总糖和还原糖的测定及葡萄糖标准曲线的绘制35二硝基水杨酸法.ppt

实验一、总糖和还原糖的测定总糖和还原糖的测定 ——3,5-二硝基水杨酸法二硝基水杨酸法一、实验目的1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理；、掌握还原糖和总糖测定的基本原理；2、学习用、学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原二硝基水杨酸法测定还原糖的方法糖的方法 二、实验原理二、实验原理§还原糖是指含有自由醛基或者酮基的糖类，还原糖是指含有自由醛基或者酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖；利用糖的溶解度不同，可将植物样原糖；利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来；品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来；对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）还原糖以葡萄糖含量计）§还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕二硝基水杨酸则被还原为棕红色的红色的3-氨基氨基-5-硝基水杨酸。

硝基水杨酸NaOH黄色黄色棕红色棕红色加热加热§在过量的在过量的NaOH碱性溶液中，碱性溶液中， 3-氨基氨基-5-硝硝基水杨酸呈橘红色，在基水杨酸呈橘红色，在540nm处有最大吸处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值成线性关系利用比色法，在光吸收值成线性关系利用比色法，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量三、实验器材1、材料：山芋粉2、仪器：电子分析天平、水浴锅、V-1100可见分光光度计、移液器3、其他：试管、容量瓶、三角烧瓶、量筒、吸管（移液管）、洗耳球、玻棒、洗瓶、漏斗、离心管、六凹反应盘、pH试纸（1～14）四、实验试剂1、标准葡萄糖溶液（1.0mg/ml）2、DNS试剂3、6mol/L HCl4、6mol/L NaOH5、I2-KI溶液五、操作1、样品中还原糖的提取准确称取0.5g山芋粉置于100ml三角烧瓶中加3ml蒸馏水，调成糊状再加30ml蒸馏水50℃水浴，30min (不时搅拌)转移至50ml离心管中，4000rpm，5min上清液1沉淀加20ml蒸馏水，洗涤沉淀，4000rpm，5min上清液2沉淀(弃)置于容量瓶中，蒸馏水定容至100ml,混匀，取1ml即可进行还原糖的测定。

2、样品中总糖的水解、提取准确称取0.2g山芋粉置于100ml三角烧瓶中加3ml蒸馏水，调成糊状再加12ml蒸馏水，5ml 6mol/L HCl沸水浴，30min (不时搅拌)取取1～～2滴于六凹滴于六凹反应盘中，加反应盘中，加1滴滴I2-KI溶液，如果溶液，如果完全不显蓝色，完全不显蓝色，即可进行下面的即可进行下面的操作冷却至室温用6mol/L NaOH调pH7.0（ pH试纸）蒸馏水定容至100ml,混匀滤纸过滤，取10ml滤液用蒸馏水定容至100ml，成稀释1000倍的总糖水解液，混匀,取1ml总糖水解液，测定其还原糖的含量3、制作葡萄糖标准曲线及还原糖、总糖制作葡萄糖标准曲线及还原糖、总糖含量的测定含量的测定 取8支洁净的试管，分别用记号笔标上0～7号，按照下表进行操作其中0～5管，用于标准曲线的制作,以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线（用Excel表制作） 管号管号试剂01234567标准葡萄糖溶液准葡萄糖溶液/ml00.20.40.60.81.01.01.0蒸蒸馏水水/ml1.00.80.60.40.2000DNS试剂/ml2.02.02.02.02.02.02.02.0沸水浴中准确煮沸沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温，取出，用自来水冷却至室温蒸蒸馏水水/ml9.09.09.09.09.09.09.09.0葡萄糖含量葡萄糖含量/mg00.20.40.60.81.0C1C2A540nmab六、计算 C1V1ω(还原糖还原糖)=——×100% m1 C2V2ω(总糖总糖)=——×0.9×100% m2附：相关仪器使用附：相关仪器使用1、移液管的使用、移液管的使用2、移液器的使用、移液器的使用3、离心机的使用、离心机的使用 注意配平，对称放注意配平，对称放4、、V-1100可见分光光度计的使用可见分光光度计的使用 比色皿比色皿V-1100可见分光光度计可见分光光度计开机预热30min§测吸光度 选择波长（540nm） MODE键切换到T，将黑体放入光路中合上盖，0键校零MODE键切换到A，参比液放入到光路中合上盖，100键调零将待测液依次放入到光路中，即可得出待测液的吸光度。