oec-sc-ecm-plga桥接体对大鼠坐骨神经缺损的修复作用.doc

外科学外科学( (野战外野战外) )专业优秀论文专业优秀论文 OEC-SC-ECM-PLGAOEC-SC-ECM-PLGA 桥接体对大鼠坐桥接体对大鼠坐骨神经缺损的修复作用骨神经缺损的修复作用关键词：坐骨神经缺损关键词：坐骨神经缺损 人工神经人工神经 神经移植神经移植 神经修复神经修复 OEC-SC-ECM-PLGAOEC-SC-ECM-PLGA摘要：周围神经缺损性损伤在临床上极为常见，虽然精细的神经显微外科技术 已用于修复周围神经缺损，但修复后神经功能的恢复仍不令人满意自体神经 移植被认为是修复周围神经缺损的最基本和最有效的方法，然而自体神经移植 需要牺牲正常神经，产生供区合并症，同时供体神经来源有限，对长段、严重、 多处的周围神经缺损的修复效果差，因此应用组织工程学原理和技术方法研制 的人工神经就成为人们关注的焦点嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OEC)是一种特殊类型的胶质细胞，具有广泛的生物学作用雪旺氏细胞 (Schwann cells，SC)是周围神经系统的成髓鞘细胞，在周围神经损伤修复中发 挥多种重要作用细胞外基质成份(extracellular matrix，ECM)对神经再生具 有明显的引导和促进作用。

聚乳酸，聚羟基乙酸共聚物(poly(DL-lactide-co- glycolide)，PLGA)是已被美国食品和药物管理局(U.S Food and Drug Administration，FDA)批准用于临床的人工神经支架材料基于上述背景，本 实验采用用四者构成 OEC-SC-ECM-PLGA 桥接体，切除大鼠 15mm 坐骨神经后，观 察其对坐骨神经缺损的修复效果据作者所知，本实验首次同时应用 OEC 和 SC 组建人工神经，因而对临床周围神经缺损修复具有参考价值，并丰富周围神经 缺损修复理论 本实验采用新生 3d SD 大鼠为供体，迅速分离嗅球的嗅神经 层和嗅颗粒层，采用酶消化法分离细胞，差速贴壁法纯化细胞，接种于多聚赖 氨酸包被的培养板内培养 2d，NGFRp75 和 S100 蛋白双标免疫组化、 Hoechst33342 复染鉴定 OEC 的纯度SC 也来自相同供体，方法为迅速分离双侧 坐骨神经后，以酶消化法和差速贴壁法分离、纯化细胞，接种于层粘连蛋白包 被的培养板内培养 2d，采用 S100 蛋白免疫组化和 Hoechst33342 复染鉴定其纯 度建立 15mm 的 SD 大鼠右侧坐骨神经缺损模型后，用 CM-DiI 标记的 OEC 和 Hoechst33342 标记的 SC、细胞外基质凝胶以及自行制备的 PLGA 支架，构建 OEC-SC-ECM-PLGA 桥接体进行修复，同时设 OEC-ECM-PLGA 组、SC-ECM-PLGA 组、 ECM-PLGA 组、PLGA 组、自体神经移植组为对照组，在术后 9w 时间内进行细胞 示踪、运动终板染色、神经纤维逆行示踪、脊髓神经元凋亡、神经再生速度、 神经电生理、形态计量等检测，以从结构和功能两个角度，外周和中枢两个层 面，全面评价所建桥接体对坐骨神经缺损的修复作用。

所取得的主要结果如 下： 1.倒置显微镜下，OEC 轮廓清晰，胞体扁平，立体感强，呈双极或多极， 突起细长，出现细胞间联系NGFRp75 和 S-100 免疫荧光鉴定的 OEC 纯度为 95％左右 2.倒置显微镜下，SC 胞体饱满，呈长梭形，两端突起较长，呈 极性生长趋势，细胞间联系不十分明显S-100 免疫荧光鉴定的 SC 纯度为 95010 左右 3.自行构建的 PLGA 神经支架在干燥状态下呈白色泡沫状结构， 表面不平，可见白色细小颗粒PLGA 支架孔隙率为 85％左右，扫描电镜下 PLGA 支架呈多孔样，孔径大小不一，腔壁光滑 4.术后 9w 时，OEC-SC- ECM-PLGA 组的脚趾自噬率低于 OEC-ECM-PLGA 组、SC-ECM-PLGA 组、ECM-PLGA 组、PLGA 组，与自体神经移植组相当 5.CM-Dil 标记的 OEC 和 Hoechst33342 标记 SC 可在桥接体内至少存活 6 周SC 的存活率高于 OEC两者沿神经纵轴呈梭形分布，并向桥接体近心端和远心端坐骨神经内迁移至少 2.5mm 6.术后 3w，OEC-SC-ECM-PLGA 组的脊髓前角凋亡细胞数为 6.8±1.6，显著低于 OEC-ECM-PLGA 组、SC-ECM-PLGA 组、ECM-PLGA 组和 PLGA 组(Plt;0.01)，但显著高于自体神经移植组(Plt;0.01)。

7.术后 9w 内，OEC-SC-ECM-PLGA 组感觉功能持续改善，回缩时间显著优于 OEC-ECM- PLGA 组、SC-ECM-PLGA 组、ECM-PLGA 组、PLGA 组(Plt;0.05)，与自体神 经移植组无显著差异(Pgt;0.05)，但未恢复至正常水平(Plt;0.05)， 其坐骨神经功能指数(sciaticfunction index，SFI)也显著好于 OEC-ECM-PLGA 组、SC-ECM-PLGA 组、ECM- PLGA 组和 PLGA 组(Plt;0.05)，与自体神经移 植组无显著差异(Pgt;0.05)，但远远未恢复至正常(Plt;0.01) 8.自术后第 6w 至第 9w，OEC-SC-ECM-PLGA 组和自体神经移植组的神经再生速度 均为 0.71±0.00 mm/d，显著快于 OEC-ECM-PLGA 组和 SC-ECM-PLGA 组的神经再 生速度(Plt;0.05) 9.术后 9w 时，OEC-SC-ECM-PLGA 组的腓肠肌湿重， 恢复至 70.77±4.25％，显著高于 OEC-ECM-PLGA 组、ECM- PLGA 组和 PLGA 组 (Plt;0.05)，与 SC-ECM-PLGA 组和自体神经移植组无显著差异 (Pgt;0.05)，但未恢复至正常水平；同时其运动终板数量已恢复至 16.4±1.1 个，显著高于 OEC-ECM-PLGA 组、SC-ECM-PLGA 组、ECM-PLGA 组和 PLGA 组的运动终板数量(Plt;0.01)，与自体神经移植组无显著差异 (Pgt;0.05)，尚未恢复到正常水平(Plt;0.01)。

10.术后 9w 时， OEC-SC-ECM-PLGA 组的神经传导速度和复合肌肉动作电位的波幅为分别为 17.77±1.40 m/s 和 3.75±0.37mV，显著高于 OEC-ECM-PLGA 组、SC-ECM-PLGA 组、ECM-PLGA 组和 PLGA 组(Plt;0.01)，与自体神经移植组无显著差异 (Pgt;0.05) 11.术后 9w 时，除 ECM-PLGA 组和 PLGA 组外其余各组均 可见 CM-Dil 和 CB-HRP 逆行标记的脊髓前角运动神经元，OEC-SC-ECM-PLGA 组 标记的神经元的数量，显著高于 OEC-ECM-PLGA 组和 SC-ECM-PLGA 组 (Plt;0.05)，与自体神经移植组无显著差异(Pgt;0.05)此外，SC- ECM-PLGA 组也显著高于 OEC-ECM-PLGA 组(Plt;0.01) 12.术后 9w 时， NF200/MBP 双标免疫组化结果显示，OEC-SC-ECM-PLGA 组、OEC-ECM-PLGA 组、 SC-ECM-PLGA 组和自体神经移植组的再生神经纤维均有髓鞘包绕 13.术后 9w 时，再生神经甲苯胺蓝染色计量结果显示，无论是中段还是远段，OEC-SC- ECM-PLGA 组的神经纤维密度显著高于 OEC-ECM-PLGA 组和 SC-ECM-PLGA 组 (Plt;0.05)，但远未达到自体神经移植组的水平(Plt;0.01)。

14.术 后 9w 时，透射电镜测量显示，无论是中段还是远段，OEC-SC-ECM～PLGA 组的 有髓神经纤维平均直径和髓鞘厚度显著高于 OEC-ECM-PLGA 组和 SC-ECM-PLGA 组 (Plt;0.01)，但远未达到自体神经移植组的水平(Plt;0.01)SC- ECM-PLGA 组远段的有髓神经纤维平均直径和髓鞘厚度也显著高于 OEC-ECM-PLGA 组(Plt;0.01) 以上结果表明： 1.OEC 和 SC 可在桥接体内至少存 活 6w 2.OEC-SC-ECM-PLGA 桥接体通过促进神经联接，提高神经再生速度， 增加有髓神经纤维密度、直径和髓鞘厚度而促进缺损坐骨神经结构恢复 3.OEC-SC-ECM-PLGA 桥接体通过减少自噬现象、缩短后肢回缩时间、提高坐骨 神经功能指数、促进足踝部溃疡愈合、提高神经传导速度和动作电位幅度而促 进缺损坐骨神经功能恢复 4.OEC-SC-ECM-PLGA 桥接体移植修复坐骨神经缺 损后，对外周靶组织的恢复具有促进作用，主要表现为促进腓肠肌湿重的恢复 和提高运动终板的数目及其长轴和短轴的幅度；对脊髓前角运动神经元具有保护作用，主要表现为减少神经元凋亡，增加神经元数量。

5.OEC 与 SC 两种 细胞合用修复坐骨神经缺损的效果优于单细胞移植其中 SC 较 OEC 为优，但其 中任何一种细胞移植的修复效果都比无细胞移植好 6.OEC-SC-ECM-PLGA 桥 接体可以促进坐骨神经缺损修复的机制可能是促进轴突再生、髓鞘再形成、减 少脊髓神经元凋亡以及其他学者报道的释放神经营养因子和导向分子等正文内容正文内容周围神经缺损性损伤在临床上极为常见，虽然精细的神经显微外科技术已 用于修复周围神经缺损，但修复后神经功能的恢复仍不令人满意自体神经移 植被认为是修复周围神经缺损的最基本和最有效的方法，然而自体神经移植需 要牺牲正常神经，产生供区合并症，同时供体神经来源有限，对长段、严重、 多处的周围神经缺损的修复效果差，因此应用组织工程学原理和技术方法研制 的人工神经就成为人们关注的焦点嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OEC)是一种特殊类型的胶质细胞，具有广泛的生物学作用雪旺氏细胞 (Schwann cells，SC)是周围神经系统的成髓鞘细胞，在周围神经损伤修复中发 挥多种重要作用细胞外基质成份(extracellular matrix，ECM)对神经再生具 有明显的引导和促进作用。

聚乳酸，聚羟基乙酸共聚物(poly(DL-lactide-co- glycolide)，PLGA)是已被美国食品和药物管理局(U.S Food and Drug Administration，FDA)批准用于临床的人工神经支架材料基于上述背景，本 实验采用用四者构成 OEC-SC-ECM-PLGA 桥接体，切除大鼠 15mm 坐骨神经后，观 察其对坐骨神经缺损的修复效果据作者所知，本实验首次同时应用 OEC 和 SC 组建人工神经，因而对临床周围神经缺损修复具有参考价值，并丰富周围神经 缺损修复理论 本实验采用新生 3d SD 大鼠为供体，迅速分离嗅球的嗅神经 层和嗅颗粒层，采用酶消化法分离细胞，差速贴壁法纯化细胞，接种于多聚赖 氨酸包被的培养板内培养 2d，NGFRp75 和 S100 蛋白双标免疫组化、 Hoechst33342 复染鉴定 OEC 的纯度SC 也来自相同供体，方法为迅速分离双侧 坐骨神经后，以酶消化法和差速贴壁法分离、纯化细胞，接种于层粘连蛋白包 被的培养板内培养 2d，采用 S100 蛋白免疫组化和 Hoechst33342 复染鉴定其纯 度建立 15mm 的 SD 大鼠右侧坐骨神经缺损模型后，用 CM-DiI 标记的 OEC 和 Hoechst33342 标记的 SC、细胞外基质凝胶以及自行制备的 PLGA 支架，构建 OEC-SC-ECM-PLG。