SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验报告.docx

试验报告一、试验目的和要求1. 了解 SSR 标记的检测方法；2. 了解 银染检测SSR 的原理；3. 把握 银染检测SSR 的技术二、试验内容和原理1. 依据 DNA 大小及类型的不同，可通过电泳进展分别聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分别 1kb 以下的片段， 最高区分率可达 1bp，适宜于微卫星等位基因间的差异检测2. 银染方法的建立始于 1979 年对蛋白质的染色，以后渐渐应用于核酸3. 银染原理：扩增 DNA 经电泳分别后，Ag+可与之形成稳定的复合物，在甲醛的作用下被复原成银颗粒， 呈现棕褐色谱带三、试验仪器与材料1、 试验材料：已预备的 12 个水稻材料的PCR 产物2、 试验耗材：PCR 管、枪头〔tip〕、1 次性塑料手套等；仪器设备：PCR 仪、电泳仪、垂直电泳槽及制胶装置、凝胶成像系统/扫描仪、移液枪、塑料托盘等3、 试剂及配制：① 引物〔10mM〕：依据含有 SSR 的序列设计而合成的，用无菌双蒸水配制所需浓度② dNTP 溶液〔2mM〕：将选购的溶液分装，直接稀释到所需浓度即可③ Taq DNA 聚合酶〔5U/μ〕l：直接选购④ 10 x PCR 缓冲液：直接选购。

⑤ DNA 分子量标准：直接选购⑥ 0.5mol/LEDTA ：在 800ml 水中参与 186.1g EDTA-Na.2H2O，搅拌并用氢氧化钠调 PH 至 8.0，定溶至1L，分装后高压灭菌备用⑦ TBE 电泳缓冲液〔Tris-硼酸 5×贮存液〕：Tris 碱 54g/L 和硼酸 27.5g/L 溶于蒸馏水，参与 20ml (pH8.0) 0.5mmol/L EDTA，定溶到 1L用时稀释 5 倍⑧ 上样液〔6×〕：溴酚兰 0.25%、二甲苯青 0.25%、蔗糖 40%的混合液⑨ 封胶液：1g 琼脂糖放于 100ml TBE 煮沸溶解、混匀⑩ 30%丙烯酰胺〔100 ml〕：将丙烯酰胺 29 克和N、N-亚甲叉双丙烯酰胺 1 克用蒸馏水溶解，定容至 1001ml或从公司直接选购的 40%〔Acr:Bis=29：1〕溶液4、 试验材料说明：① SSR 标记：共 6 个，每组 1 个② 模板 12 个：C101、谷梅 2 号、谷梅 4 号、 IR24、 IR64、富锦、CK122、株 6S、 R2106、 316S、 R248、日本晴③ PCR：反响总体积为 15μl ，包括 7.5μl 的 2×Taq Master Mix(含 dNTP)，1μl 的模板DNA(50-100ng)，10μM的上下游引物各 0.5ul，用去离子水补足至 15μl ；94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min， 共 35 个循环；72℃延长 8min，4℃下保存。

④ 样品：每组领取 12 个PCR 样品，记录组号和点样位置四、操作方法和试验步骤1、 组装玻板与封胶：将玻璃板与胶皮套组放在一起，并用封胶液(1%琼脂糖)将底步空隙封闭，制成铸胶槽2、 制胶：配制 40ml 的 8%胶液先加水，最终加 TEMED 和 10%过硫酸铵，混匀后马上注入铸胶槽中， 并插入梳子，静止聚合 40 分钟以上在灌胶时留意不要产生气泡3、 上样：凝胶完全聚合后拔出梳子，用电泳缓冲液冲洗梳 2-3 次，然后在上下槽中加满电泳缓冲液后即可点样电泳在含扩增产物的反响管中按1:5 参与上样缓冲液混匀〔已做〕，取 0.8μL 轻轻加到梳孔中4、 电泳：点样完毕后，恒压 120V〔可依据时间适当调整〕电泳至溴芬兰至胶板底部〔2h〕5、 剥胶与固定：留神剥下凝胶，去离子水漂洗，然后参与固定液，轻摇固定10-15 分钟〔固定步骤可省略〕6、 染色：倒去固定液，去离子水中漂洗，参与染色液，轻摇染色10 分钟7、 显色：去离子水洗 2 次，参与显色液，轻摇显色；观看条带的消灭状况，当条带显示清楚后，马上参与 10%乙酸终止，然后加水冲洗8、 记录结果：拍照或记录结果，试验报告中写明SSR 标记〔组号〕、材料名称，计数扩增带数〔表格〕，计算材料间的遗传相像系数和所用标记的多态信息含量等，并对结果及相关问题进展争论。

五、试验数据记录和处理1、电泳结果记录：使用 3 号RM3867 的聚丙烯酰胺凝胶电泳分别与银染检测结果如以以以以下图1：图 1 使用 3 号RM3867 的聚丙烯酰胺凝胶电泳分别结果，将各泳道从左到右编号为 1-12，对应模板分别为C101、谷梅 2 号、谷梅 4 号、IR24、IR64、富锦、CK122、株 6S、R2106、316S、R248、日本晴依据上图 1，除去无法识别的12 号材料电泳结果，与已有的结果图比照，可确定我们组使用的是RM3867记录RM3867 在 12 个材料中的扩增状况，如下表 1：表 1 RMX 在 12 个材料中的扩增状况材料 C101 谷梅 2 号 谷梅 4 号 IR24 IR64 富锦 CK122 株 6S R2106 316S R248 日本晴条带数3 3 3 3 33 4 3 3 3 32、计算材料间的遗传相像系数和所用标记的多态信息含量依据图1 及遗传相像系数(GS)公式GS=2Nij/(Ni+Nj)计算，12 个材料之间遗传相像系数结果如下表2〔Nij为材料i 和 j 共有的扩增片段数目，Ni 为材料i 中扩增片段数目，Nj 为材料j 中扩增片段数目〕：表 2 12 个材料之间的遗传相像系数GSC101谷梅 2 号谷梅 4 号IR24IR64富锦CK122株 6SR2106316SR248日本晴C10110.3311110.570.330.670.670.670.67谷梅 2 号0.3310.330.330.330.330.8610.670.670.670.67谷梅 4 号10.3311110.570.330.670.670.670.67IR2410.3311110.570.330.670.670.670.67IR6410.3311110.570.330.670.670.670.67富锦10.3311110.570.330.670.670.670.67CK1220.570.860.570.570.570.5710.860.860.860.860.86株 6S0.3310.330.330.330.330.8610.670.670.670.67R21060.670.670.670.670.670.670.860.671111316S0.670.670.670.670.670.670.860.671111R2480.670.670.670.670.670.670.860.671111日本晴0.670.670.670.670.670.670.860.671111RM3867 的多态信息含量：PIC=1- pij2=1-(52/122+42/122+12/122+22/122)=0.681六、试验结果与分析由以上各图表：1) 依据图 1 条带，12 个样品的条带数均为 3 条，且消灭了三种带型，1、3、4、5、6 号样品的条带为同一种带型，2、7、9、10、11 号样品的条带为另一种带型，8 号样品条带为第三种带型，由此可以推断RM3867 可检测到 3 个等位基因，3 种基因型，表现出确定的多态性。

2) 9 号样品的条带发生了明显的倾斜，推想可能是由于凝胶浓度不均一，或是胶体倾斜3) 12 号样品的条带无法辨识，可能是制胶的问题，加样孔靠近胶的边缘，样品加到加样孔中后不能沉到底部，始终处于悬浮状态，加了三次也未加样成功4) 依据表 2，前 11 种样品材料间遗传相像系数变化范围 0.33~1，平均数为 0.759，整体较高，说明前 11个样品之间存在确定的亲缘关系5) 依据图 1 和表 2 遗传相像系数结果，C101 谷梅 4 号、 IR24、 IR64、富锦亲缘关系较近，谷梅 2 号、CK122、R2106、316S、 R248 亲缘关系较近，株 6S 和这 10 种亲缘关系均较远6) PIC 值指的是一个标记用于在群体检测多态性的价值，等位基因频率越公正，PIC 值就越大，从我们计算的结果来看，RM3867 标记的多态信息含量为 0.579，说明RM3867 标记在确定程度上可衡量样品群体的多态性，7) 试验得到的凝胶背风光较浓、区分率不高，在统计时可能会造成误判，导致分析结果不完全准确七、争论、心得1、试验显色后觉察凝胶背景的颜色过深导致条带结果不是很清楚，可能造成的缘由有：1) 试验中用于配制电泳缓冲液的水不是真正的超纯水或者放置时间过长有污染，带有确定离子会与 Ag+发生反响，造成背景颜色变深。

2) 银染反响的碱性不够有争论觉察，银染反响的进展需要一个碱性〔参与NaOH、KOH 等〕的环境， 随着试验环境碱性的增加，胶的背景可变浅，并有助于祛除胶中非特异的银颗粒，而当NaOH 浓度低于 2%时，胶的背景变深，不利于 DNA 带的显现而在显色液中参与少量其他的非中性弱酸盐如NaHCO3、CHOONa、CHOOK、EDTA-Na 等等，有助于条带的显现，并保持显带的稳定性，维持胶的浅色背景， 使其在显色液中较长时间放置背景也不会加深3) 试验操作过程中参与终止剂后显色没有马上终止，造成背景颜色连续加深，可能是参与终止剂后混合不够均匀或者终止反响需要确定时间应在消灭显色条带后马上参与终止剂并充分混匀而不是条带充分清楚后参与终止剂，防止背景颜色过深不利于观看分析2、多数PCR 扩增片段承受的琼脂糖凝胶电泳、EB 染色只可检测出少于 10ng 的 DNA，且琼脂糖电泳的区分率较低而聚丙烯酰胺凝胶电泳区分力极高，用于测序的聚丙烯酰胺凝胶可分别相差1bp 的 DNA 片段， 能够将品种特异性的谱带分别出来，进而判定纯度和真实性，特别适合于像SSR 这样的小片段扩增产物的检测。

这是由于两种介质的分子构造、交联状况及其浓度大小变化形成的分子筛孔径不同，两者的分别范 围和分别精度存在较大差异会对聚丙烯酰胺凝胶结果产生影响的因素较多，不同的试验处理对成像结果都有影响，甚至会影响试 验结果分析，因此需要通过预试验对聚丙烯酰胺凝胶电泳参数进展优化，如聚丙烯酰胺凝胶的浓度、电泳 时间及染色过程的各种细节都是其中重要的参数操作者在试验工作过程中确定要认真缜密，才能得到 PCR 标记产物多态性条带清楚、光明、稳定的试验结果3、本试验使用的银染法，具有染色结果明显的特点，适合于非标机引物检测银离子可与核酸形成稳定的 复合物，然后用。