槲皮素和17-AAG对大鼠外周血淋巴细胞、骨髓细胞和人淋巴瘤细胞株Raji细胞增殖与辐射敏感性的研究.pdf

中文提要目的：研究探讨槲皮素对大鼠外周血淋巴细胞骨髓细胞和人淋巴瘤细胞株R a j i 细胞增殖抑制作用及联合丫射线研究辐射敏感性的影响研究探讨1 7 ．A A G对大鼠外周血淋巴细胞和骨髓细胞增殖抑制作用及联合丫射线研究辐射敏感性的影响研究探讨槲皮素联合1 7 ．A A G 对大鼠外周血淋巴细胞增殖抑制作用方法：采用C C K ．8 法检测细胞生长增殖和A n n e x i nV ／P I 双染色法检测细胞早期凋亡率研究槲皮素对体外培养人B u r k i t t ’s 淋巴瘤细胞株R a j i 细胞的增殖、凋亡和辐射敏感性的影响并探讨其可能机制采用C C K ．8 法测定细胞活性，研究不同浓度槲皮素和1 7 ．A A G 对大鼠外周血淋巴细胞和骨髓细胞增殖作用和辐射敏感性的影响采用C C K ．8 法测定细胞活性，研究槲皮素联合1 7 ．A A G 对大鼠外周血淋巴细胞存活率的影响结果：1 槲皮素对R a j i 细胞有生长增殖抑制作用，且有一定的时间依赖关系，对R a j i 细胞有一定的辐射增敏效应2 在短作用时间和低药物浓度时，槲皮素对大鼠外周血淋巴细胞有一定的保护作用，对大鼠外周血淋巴细胞辐射敏感性有减弱作用。

槲皮素对大鼠骨髓细胞有一定的保护作用，保护作用与药物浓度和作用时间呈明显正相关，对大鼠骨髓细胞辐射敏感性有减弱的作用( P 6 0 u m o l ／L ) 经一定时间作用存活率 8 0 u m o l ／L 时，作用不同时间的R a j i 细胞早期凋亡率出现明显变化，有显著差异( p 6 0 u m o l ／L 时，用槲皮素对R a j i 细胞预处理2 4 小时，辐射诱导的细胞凋亡率增加超过一倍，表明槲皮素对R a j i 细胞明显的辐射增敏效应槲皮素浓度 6 0 u m o l ／L ) 时，R a j i 细胞的生长和增殖受到明显抑制，槲皮素的细胞毒性作用在高浓度范围内可以明显体现出来为了探讨槲皮素对细胞生长增殖抑制作用的机制，观察与诱导细胞凋亡之间的关系，测得槲皮素不同浓度和不同作用时间作用于R a j i 细胞的早期凋亡率凋亡实验结果显示：R a j i 细胞的早期凋亡率在槲皮素低浓度时变化不明显，但当大浓度槲皮素( > 4 0 u m o l ／L ) 作用于R a j i 细胞时，其诱导凋亡作用明显，有一定的相关性，既随着槲皮素作用浓度的增加，一定作用时间内其诱导R a j i 细胞的凋亡率增加，对R a j i 细胞的生长和增殖抑制作用也越明显。

综合上述结果提示，低浓度槲皮素( 6 0 u m o l ／L ) 作用于R a j i 细胞后对R a j i 细胞的生长和增殖抑制作用明显高浓度槲皮素作用于R a j i 细胞后，生长和增殖的抑制率与槲皮素的作用浓度和作用时间之间存在一定的相关性通过早期凋亡率的检测发现高浓度的槲皮素作用于R a j i 细胞后能明显诱导R a j i 细胞发生早期凋亡，且早期凋亡率与槲皮素作用浓度之间存在一定剂量关系实验结果表明槲皮素可以诱导R a j i 细胞的凋亡其诱导凋亡的作用机理需要更进一步研究，同时对正常细胞和组织的毒性效应也需要进一步的研究放射治疗是肿瘤治疗的主要方法之一，约7 0 ％的肿瘤病人需要进行放射治疗，而肿瘤细胞的辐射敏感性直接影响肿瘤的放疗效果目前临床上提高肿瘤的辐射敏感性主要利用化疗药物如顺铂、泰素等，但是由于化疗药物对正常细胞的毒性作用较大，且与放疗的副反应有协同作用，病人一般难以耐受，因此寻找提高肿瘤细胞辐射敏感性的方法有着重要的实际意义目前研究的最多的提高肿瘤辐射敏感性的方法是使用辐射增敏剂理想的辐射增敏剂应当具备以下特点：( 1 )对肿瘤细胞有增敏作用，而对正常组织细胞无此作用或作用很小；( 2 ) 应具有合适的脂水分配系数和较长的生物半存留期：( 3 ) 对正常组织的副作用低；( 4 ) 易于用药，分次低剂量照射也有增敏作用。

由于辐射增敏剂的要求较高，寻找完全符合条件的辐射增敏剂非常困难，目前，尚未有一种完全符合上述条件的理想辐射增敏剂被发现或制造出来近年来，在肿瘤治疗过程中发现一些抗肿瘤药物在对肿瘤细胞或组织有细胞毒性的作用的同时对肿瘤的放疗有增敏作用，在医疗科研及临床工作中，把这些毒性可以接受并具有辐射增敏效果的药物作为辐射增敏剂使用目前，辐射增敏剂可以分为很多种，如乏氧细胞增敏剂、中药提取剂、潜在致死性损伤修复抑制剂、聚合酶抑制剂等而有关辐射增敏剂在肿瘤放射治疗过程中的增敏作用的机制的研究日益增多肿瘤细胞辐射敏感性与细胞凋亡、细胞周期改变、D N A 损伤修复等因素有关，调控肿瘤细胞的凋亡是提高肿瘤辐射增敏性的重要手段，M e y n等【4 8 】研究发现肿瘤细胞在接受单一剂量照射后，凋亡指数的高低与辐射敏感性之间呈一定正相关T a k a b a s h 等[ 4 9 】通过体内实验也显示：在不同的肿瘤之间，其肿瘤的辐射敏感性和肿瘤细胞的凋亡指数有关，接受相同的照射剂量后，放疗最不敏感的恶性胶质瘤的凋亡指数最低，室管膜母细胞瘤对辐射敏感，辐射诱导的室1 6塑鏖耋塑! ! 丝鱼型垦坐鲞垦塑堕量壁塑堕塑△燮里堕塑墼壁墅! 墅墼擅堕皇塑塾壑壁丝笪堑窒箜= 垫坌管膜母细胞瘤凋亡最高。

这些研究为凋亡作为辐射敏感性预测的指标提供了支持所以，本实验选定以B u r k i t t ’S 淋巴瘤R a j i 细胞的早期凋亡率为指标来检测槲皮素对R a j i 细胞有没有辐射增敏作用本研究中检测槲皮素预处理后辐照对R a j i 细胞与单纯对R a j i 细胞辐照之间相比较其增殖抑制情况，结果提示，槲皮素浓度 6 0 u m o l ／L 时，预处理组与对照组相比R a j i 细胞存活率明显下降，有显著差异，提示在较高槲皮素浓度时，对R a j i细胞进行预处理后照射，可以降低R a j i 细胞的存活率，增加其辐射敏感性通过对经槲皮素预处理后照射的R a j i 细胞的凋亡结果分析，不同浓度槲皮素预处理后的R a j i 细胞其2 4 h 早期凋亡率明显高于对照单纯照射组，槲皮素增加R a j i 细胞的辐射敏感性可能通过凋亡及其相关途径发挥作用，但具体机制需要进一步研究同组实验人员还发现槲皮素对H e l a 细胞有增殖抑制作用，并且有辐射增敏作用，所以我们初步可以认为槲皮素对肿瘤细胞有增殖抑制作用并且有辐射增敏作用，但槲皮素对正常细胞作用还不太清楚，所以我们下一步将就槲皮素对大鼠外周血淋巴细胞和骨髓细胞生长增殖影响以及辐射敏感性的影响进行探讨。

1 7第二部分槲皮素和1 7 - A A G 对鼠血淋巴细胞骨髓细胞和人淋巴瘤细胞株R a j i 细胞增殖与辐射敏感性的研究第二部分槲皮素对大鼠外周血淋巴细胞和骨髓细胞 生长增殖以及辐射敏感性的影响一、实验材料1 ．细胞来源及细胞培养雄性W i s t a r 大鼠( 苏州大学动物实验中心提供) ，体重1 5 0 - J ：5 9 无菌环境下，由大鼠腹主静脉采血，F i c o l l 法分离大鼠外周血淋巴细胞，后在含2 0 ％d 、牛血清、1 0 0 9 9 ／m LP H A 、1 0 0 U ／m L 青霉素和1 0 0 9 9 ／m L 链霉素的R P M l l 6 4 0 培养基中，于3 8 C 、5 ％C 0 2 、饱和湿度条件培养2 ．实验仪器5 ％C 0 2 培养箱( T h e r m o 公司F o r m aS e r i e sI I )超净工作台( 苏州净化设备厂)倒置相差显微镜( O l y m p u s 公司C K 4 1 )制冰机( S I M ．F 1 4 0 三洋)高速冷冻离心机( 518 0 型E p p e n d o r 0电子分析天平( 上海精科F C 2 0 4 )电热恒温鼓风干燥器( 上海精宏D H G ．9 2 4 6 )低温冰箱( T h e r m oF o r m a - 8 6 e )酶标仪( p o w e rw a v eX S ，B I O ．T E K )9 6 孔U 型底细胞培养板( C o m i n g ) ，细胞计数板，微量加样器( E p p e n d o r f ) ，细胞培养用盖玻片，培养瓶，西林瓶，培养皿，毛细滴管，刻度滴管，吸管，刻度离心管，镊子，剪刀，止血钳，乳胶手套，尼龙网，各种规格的一次性注射器，搪瓷盘，各种规格的烧杯和量简等均购自苏州大学实验材料供应中心。

普通光学显微镜，超净工作台等3 ．细胞培养基及相关材料R P M l l 6 4 0 细胞培养基( G i b c o ) 和胰酶购自华美生物工程公司，小牛血清，1 0 0 U ／m L 青霉素，1 0 0 U ／m L ( P A A 公司) 购自上海微科公司，淋巴细胞分离液购自上海精华生物高科技有限公司，P H A 购自广州市医药工业研究所槲皮素、1 7 ．1 8槲皮素和1 7 一A A G 对鼠血淋巴细胞骨髓细胞和人淋巴瘤细胞株R 萄i 细胞增殖与辐射敏感性的研究第二部分A A G 、姬姆萨染剂及二甲亚砜均购自美国S i g m a 公司C e l lC o u n t i n gK i t t ．8( C C K ．8 ) 试剂盒购自上海同仁化学研究所9 6 孔培养板购自美国C o s t a r 公司4 ．主要溶液配制( 1 ) R P M l l 6 4 0 细胞培养液：R P M l l 6 4 0 培养基粉末1 0 ．0 9 ，H E P E s2 ．0 9 ，N a H C 0 32 ．0 9 ，按顺序溶于纯水中，定容到1 0 0 0 m L ，抽滤除菌，．2 0 “ C 保存备用，大鼠外周血淋巴细胞和骨髓细胞培养时加入2 0 ％的小牛血清和2 1 ．t g ／m l P H A 。

2 ) D —H a n k s 液：K C l 0 ．4 9 ，K H 2 P 0 4 0 ．0 6 9 ，N a C l8 ．0 9 ，N a H C 0 31 ．0 9 ，N a E H P 0 4 0 ．1 3 6g ，依次溶于9 0 0 m l 双蒸水中，定容至1 0 0 0 m l ，高压消毒灭菌备用 3 ) 0 ．0 1m o l ／L P B S 缓冲液：N a C l8 ．0 9 ，K C lO ．2 9 ，柠檬酸三钠1 ．O g ，葡萄糖1 ．0 9 ，N a H C 0 31 ．0 9 ，N a H 2 P 0 40 ．0 5 9 溶于9 0 0 m l 蒸馏水，定容至1 0 0 0 m l ，高压消毒灭菌备用 4 ) 红细胞裂解液：N H C l 0 ．8 2 9 9 ，K H C 0 30 ．1 9 ，E D T A 0 ．0 0 3 7 2 9 ，依次溶于8 0 m l 单蒸水中，定容至1 0 0 m l ，抽滤除菌备用 5 ) 槲皮素的配制：槲皮素0 ．6 7 7 9 溶解与1 0 m l D M S O 中，抽滤除菌，．2 0 “ C保存备用需要时稀释至工作液，工作液中D M S O 浓度小于0 ．1 ％。

二、实验方法1 ．大鼠外周血淋巴细胞和骨髓细胞的提取和培养雄性W i s t a r ( 苏州大学动物实验中心提供) ，体重1 3 0 - a ：5 9 1 ) 用无水乙醚麻醉大鼠，无菌环境下，由腹主静脉采血，肝素抗凝，并用D ．H a n k s 液稀释2 ．3 倍；( 2 ) 将F i c o l l 淋巴细胞分离液( 相对密度为1 ．0 7 7 ) 事先分装预离心管中，使其沉于管低；( 3 ) 用吸管将经过稀释的血细胞悬液沿管壁缓慢加入，不让细胞悬液冲破分层液界面，使其悬于分层液上方；( 4 ) 以2 0 0 0 r ／m i n 离心2 0 分钟后，不同细胞可依密度不同而分布于不同位置上，淋巴细胞层分布在F i c o l l 层上方；( 5 ) 收集浑浊带，分离获得的淋巴细胞。