运用代谢组和转录组解析人参皂苷组织和发育特异性的代谢差异.docx

运用代谢组和转录组解析人参皂苷组织和发育特异性的代谢差异人参 (Panax GinengC.A.Mey) 和西洋参 (Panax quinquefolius L.) 系五加科人参属中重要的两种药用植物人参皂苷是人参和西洋参主要药效成分之一 , 目前已鉴定出 30 余种人参皂苷综合性研究皂苷在不同组织部位及发育阶段的特异性积累方式 , 对人参属药材资源的有效保护 , 开发及利用具有重要意义 近年来 , 针对人参和西洋参中皂苷的药理活性及作用机制等领域研究广泛 , 人参的主要功效为“安神、定魂魄、治惊悸、明目和益智等” , 西洋参的主要功效为“抗疲劳 , 抗缺氧作用 , 抗心率失常和抗应激等作用”因此可知 , 人参和西洋参药效间存在显著差异 , 然而我国各大人参交易市场现已出现人参和西洋参交易混乱现象 , 主要表现为 , 以次充好 , 以西洋参代替人参进行贩卖 , 这种现象的出现严重破坏了人参属这一药材食用的安全性 , 因此找出一个快速鉴定两物种的方法为维护安全稳定的人参交易市场提供有利的科学支撑随着代谢组和转录组两大组学的快速发展 , 已被广泛的应用到揭示活性成分代谢调控网络以及主要合成基因的挖掘。

因此 , 运用该两大组学对人参属的代谢调控网络的揭示和探究不同组织部位中差异表达基因 , 对人参皂苷的合成的代谢网络调控和分子机制具有重要意义 ,同时也为人参种属的区分提供潜在的标志化合物和理论支撑 本文拟建立人参和西洋参主根 , 侧根 , 叶片 , 茎和叶柄这五个不同部位的靶向代谢分析 , 基于UPLC-MS对 10 种人参皂苷同时进行定性 , 定量及比较研究该方法检测时间短 , 精准度高 , 具有较高的灵敏度 , 回收率和重复性 , 为今后人参药材的分析提供稳定可靠的检测方法 在对人参不同发育阶段比较不同组织部位的人参皂苷含量积累特异性研究中 , 发现大多数人参皂苷随发育阶段的增加而显著积累 , 且主要积累在主根中 , 顺次为侧根 , 茎 , 叶柄和叶片中此外 , 以人参皂苷作为鉴定两物种的主要参数 , 对比了 5 年人参和西洋参不同组织部位 10 种皂苷的分布情况 , 研究表明皂苷 Rg3主要积累在人参的叶柄中 ,是西洋参的 80 倍, 皂苷 Rb2/Rb1值在西洋参叶片中为 0.05, 在人参叶片中为 1.1,然而在西洋参茎中为 0.1, 人参茎中为 1.2 因此皂苷 Rg3 和 Rb2/Rb1 这两个参数可以作为鉴定人参与西洋参叶片 , 茎和叶柄的主要标记物。

此外 , 通过主成分分析我们可以清晰的得知两物种地上部与地下部可以清晰分开区别于之前其他研究人员利用主根对两物种进行鉴定的方法 , 该鉴定方法可以在保护主要药用材料主根同时 , 针对两物种地上部材料进行物种鉴定筛选这一综合性的分析 , 可以用于鉴定人参属及其发育阶段 , 同时了解皂苷组织特异性分布为药材开发利用和食用安全性提供可靠的科学证据在本研究中 , 首次将非靶向代谢组学 GC-MS平台技术应用到人参和西洋参中对其初级代谢产物进行鉴定分析结合多元统计分析筛选出鉴定物种间以及组织部位间差异代谢物 , 同时结合皂苷检测结果将数据整合 , 最终构建出一个可视化两物种代谢物差异代谢网络 ,为揭示两物种皂苷合成通路提供新的研究思路研究结果表明 , 在人参和西洋参主根 , 侧根 , 叶片 , 茎和叶柄中共鉴定出 149 种初级代谢产物 , 其中包含糖(Sugar)14 个, 酸(Acid)39 个, 醇类 (Alcohol)14 个, 氨基酸 (Amino acid)29 个,未知化合物 (Unkonw)24 个和 29 个未分类化合物 (Unclassified) 对各物种组织间特异性建立 PLS-DA模型 , 最终共鉴定 18 个化合物作为区分各组织间的主要差异代谢物。

随后运用同样的分析方法对各物种间进行分析 , 最终共鉴定物种间差异代谢物为 : 主根中 11 个, 侧根中 18 个, 茎中 8 个, 叶中 16 个和叶柄中 12 个差异物 (VIP>1,p<0.05) 最终将 GC-MS和 LC-MS代谢物相结合构建可视化代谢调控网络 , 用于详细了解初级代谢产物与皂苷合成的相关性及特异性组织分布此外 , 针对 C 代谢和 N代谢作为研究基础对代谢物进行分析 , 结果表明 C 代谢和 N 代谢对人参皂苷合成具有重要作用人参皂苷含量的积累主要取决于主根和侧根的能量代谢 , 并且独立于地上部光合作用此外 C同化到 C积累的高转换率与人参皂苷的积累有着密切的相关性 ,主要表现在人参主根中和西洋参侧根中此外 , 本文利用高通量测序技术全面构建五年生人参主根 , 侧根 , 叶片 , 茎和叶柄五个组织部位的转录组数据库并筛选人参各组织部位差异表达基因 , 为进一步发掘人参功能基因和皂苷合成关键基因 , 阐明人参药效物质 , 选育优良品种等提供理论基础最终共获得 130.90Gb Clean Data, 各样品 Clean Data 均达到7.50Gb, 组装后共获得 61,574 条 Unigene。

对 Unigene 进行功能注释 , 共获得 28,956 条 Unigene 的注释结果通过对比主根 , 侧根 , 叶片 , 叶柄和茎的转录组数据 , 筛选出存在显著差异高表达基因最多的一组 , 最终筛选出主根和叶片之间共存在 4233 个差异表达基因 , 其中 2568个基因显著积累在主根中 , 另 1665 个基因高表达在叶片中随后我们针对主根和叶片中差异基因进行 GO功能分析 ,COG分析和 KEGG代谢通路分析共有 1.6605 个在 GO功能被分为生物学过程 (Biological process),细胞组成 (Cellular component) 和分子功能 (Molecular function) 主根和叶片差异基因中共形成 1,595 条 COG注释 , 其中通过功能预测(General function prediction only) 类的 DEGs最多 , 这些差异基因主要扮演者维持支撑正常的生理功能和参与植物基本调控表达 随后进行了 KEGG代谢通路分析 , 将 4233 个差异基因最终注释到了 111 个代谢通路人参主根和叶片之间的差异基因主要是参与碳代谢的生物合成 , 氨基酸生物合成和其他生物合成的相互作用 , 并在其中挥发主要的调节作用。

通过对比主根和叶片中差异基因的筛选 , 我们筛选出 FPKM值>1000 的高表达基因 , 主根中筛选出 12 个高表达基因 , 叶片中筛选出 21 个高表达基因在主根中高表达的基因为 GBR5,是叶片中的 504 倍 GBR被鉴定参与人参皂苷生物合成的主要调控基因PgPR显著高表达在主根中与人参皂苷 Re显著积累存在一致性 , 意味着 PgPR作为主要合成皂苷 Re 的主要基因此外 , 在叶片中筛管蛋白 2-2(Phloemprotein2-2) 作为高等植物细胞壁的组成部分 , 在植物防御机制中起到重要调控作用 , 并且在叶片中表达量是主根中 189 倍细胞色素 P450(CYP450)被认为可以作为在叶片中人参三醇型皂苷积累主要调控基因 。