【最新word论文】hIGF-1基因转染促进退变椎间盘Ⅱ型胶原的表达【医学专业论文】.doc

1hIGF-1 基因转染促进退变椎间盘Ⅱ型胶原的表达作者：黄宗强，刘尚礼，郑召民【摘要】 ［目的］探讨人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor-1,hIGF-1)基因在退变椎间盘中的表达及对椎间盘中Ⅱ型胶原表达的影响［方法］参考文献〔1〕制备出腰椎间盘退变（intervertebral disk degeneration,IVDD)动物模型 24 只，随机分为携带 hIGF-1 基因重组腺病毒（Ad/CMV-hIGF-1)、hIGF-1 生长因子及 PBS 组L4、5、L5、6 椎间盘中分别注射 25 μl 第 2 代 Ad/CMV-hIGF-1(8×108 PFU)、hIGF-1 生长因子（100 μg/L)、PBS注射后 1、2、4、8 周，Western blot 检测 hIGF-1 蛋白表达；半定量 RT-PCR 检测Ⅱ型胶原 mRNA 的表达 ［结果］hIGF-1 蛋白带出现在 7 540.00 uAd/CMV-hIGF-1 组 hIGF-1 蛋白表达持续达 4 周以上，hIGF-1 组表达持续约 2周；PBS 注射组无 hIGF-1 蛋白表达。

Ⅱ型胶原电泳条带出现在 200～300 bp；在注射后 1～4 周，Ad/CMV-hIGF-1 组内Ⅱ型胶原 mRNA 相对表达量进行性增加，8周轻度下降，4 个时期比较（F=12.18，P＜0.001)；注射后 1～8 周，hIGF-1 注射组、PBS 注射组Ⅱ型胶原 mRNA 相对表达量进行性下降（F=27.38、21.56，P＜0.001)相同时间点 3 组比较，Ⅱ型胶原 mRNA 相对表达量 Ad/CMV-hIGF-1 组最高，PBS 组最低（F=27.31～39.85，P＜0.001） ［结论］hIGF-1 基因在退变椎间盘中的表达能够促进合成Ⅱ型胶原 【关键词】 椎间盘； 退变；表达； hIGF-1Abstract［Objective］To study the role of hIGF-1 gene on collagen type Ⅱ expression of degenerative intervertebral disk.［Method］Twenty-four male New-Zealand rabbits intervertebral disk degenerontion (IVDD) models were done according to reference and randomly divided into Ad-CMV-hIGF-1,hIGF-1 growth factor and PBS group.Twenty five microlitre the second generation Ad/CMV-hIGF-1(T=80×109 PFU/L),hIGF-1 growth factor(100 μg/L)and PBS were respectively injected into L4、5,L5、6 intervertebral disk under fluoroscopic guidance.One,two,four and eight weeks post-operation,rabbits were sacrificed,intervertebral disk samples were harvested.Total proteins of equal mass intervertebral disks were extracted,isolated in SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)and transferred to polyvinylidene difluoride(PVDF)Millipore.The hIGF-1 growth factor expression were indentified with Western blot.Collagen type Ⅱ gene fragments were amplified with RT-PCR,and relative expression was done with GAPDH as intern control.［Result］The hIGF-1 interest protein existed at 7.6 Kilo-Dalton.At one week after injection,its expression quantities were almost equal between Ad/CMV-hIGF-1 and hIGF-1 growth factor group.At two week after injection,it obviously declined in 2hIGF-1 growth factor group.At four week after injection,it still expressed in Ad/CMV-hIGF-1 group.At eight week after injection,it did not express in theree groups.Collagen type Ⅱ mRNA relative expressions increased significantly from one to four weeks after injection,declined slightly at the end of eight weeks in Ad/CMV-hIGF-1 group.However,they appeared to decrease continuously in the other two groups with time.At the corresponding phases,those in PBS group were the lowest.［Conclusion］Ad/CMV-hIGF-1 could successfully infect degenerative intervertebral disk.The hIGF-1gene expression could last four weeks and could stimulate collagen type Ⅱ synthesis in Ad/CMV-hIGF-1 group.Key words：intervertebral disk; degeneration; expression; insulin-like growth factor-1椎间盘退变（intervertebral disk degeneration,IVDD）的确切分子生物学机制尚不明确。

多数学者认为 IVDD 为多因素协同作用的结果，与椎间盘中细胞营养下降、力学及遗传等因素有关，但细胞因子减少及致炎因子增多等分子生物学改变在发病中起主要作用〔2〕 1991 年，Thompson 等〔3〕检测了多种细胞因子能够促进犬椎间盘细胞分泌细胞外基质，开始了生长因子应用于椎间盘的体外实验研究，而后相继出现了多篇文献报道〔4〕 但椎间盘细胞的体外培养条件与体内椎间盘细胞所处的内环境有明显差异：生长因子维持作用短暂；发挥作用需要多次或者连续给药，造成给药途径引发感染等；另外生长因子的费用亦不菲转基因技术的发展为解决生长因子持续作用于椎间盘带来便捷之道Nishida 等〔5〕以腺病毒为载体，将 Lac Z 基因、TGF-β1 基因转染到正常成年兔椎间盘获得成功但与正常椎间盘有明显区别的是，椎间盘发生退变后，其细胞数量减少功能不活跃，在生物学特性方面与正常细胞存在明显差异退变的椎间盘细胞在椎间盘退变的生物学环境中能否被转染仍是未知即便能够转染，转染后基因表达水平如何，能否起到修复 IVDD 的作用，均需进一步研究本研究将自行构建的 Ad/CMV-hIGF-1 载体〔6〕直接注入新西兰大白兔 IVDD 模型〔1〕 ，观察hIGF-1 表达水平及表达后对退变椎间盘细胞合成Ⅱ型胶原的影响，旨在通过体内实验，为 IVDD 的基因治疗提供直接实验依据。

1 材料与方法1.1 主要实验材料、仪器及设备TRIzol 试剂（GIBCO BRL，美国） ；DEPC、PCR 引物及 Tween 20（上海生物工程有限公司，中国） ；RNA 酶抑制剂（华美公司，中国） ；蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad 公司，美国） ；鼠抗人 IGF-I 单克隆抗体（R&D Systems Inc,美国） ；辣根过氧化物酶结合的抗鼠 IgG(Santa Cruz Biotechnology,英国） ；预染蛋白质分子量 Marker(New England BioLabs Inc,英国） ；PVDF 膜（Millipore,美国） ；丙烯酰胺，抑蛋白酶肽，苯甲基磺酰氟及 N’，N’-亚甲双丙烯酰胺（Amresco,美国） ；N’ ，N，N’ ，N’-四甲基乙二胺（Sigma,美国） ；DNA Marker3及 RT-PCR 试剂盒（Takara 公司，中国） ；PCR 仪（PE 公司，美国） ；Hettich 32R 台式低温高速离心机（Heraeus,德国） ；台式常温高速离心机（Eppendorf 5415c,德国） ；恒压恒流水平电泳仪及垂直电泳电转移槽（Bio-Rad，美国） ；-80 ℃低温冰箱，立式大型水平离心机及 Biofuge 22R 台式低温离心机（Heraeus,德国）;凝胶摄像系统（Polaroid,美国） ；XW-80 漩涡振荡器及振动摇床（上海跃进医疗器械厂，中国） 。

1.2 动物实验1.2.1 hIGF-1 生长因子、第 2 代 Ad/CMV-hIGF-1 载体溶液的配制将 hIGF-1 生长因子用 PBS 溶液稀释，分装入 EP 管中，每管 2.5×10-3 μg，-70 ℃保持，使用前加 PBS 至 25 μl，每个椎间盘注入的剂量为 2.5×10-3 μg参考文献〔7〕合成的第 2 代 Ad/CMV-hIGF-1 载体稀释到每 25 μl 含有2×106 PFU每个椎间盘注入的腺病毒总量为 2×106 PFU1.2.2 腰 IVDD 动物模型制备、给药及标本制备参考文献〔1〕制备出腰 IVDD 动物模型 24 只，随机分为 Ad/CMV-hIGF-1、hIGF-1 生长因子及 PBS 组，每组有新西兰大白兔 8 只实验动物用氯氨酮针35～50 mg/kg、氯丙嗪针 10～25 mg/kg 联合肌肉注射，动物麻醉成功后，右侧卧位于手术台（本研究组设计定做） 在 X 线透视下，用硬脊膜穿刺针穿刺L4、5、L5、6 椎间盘，穿刺成功后，拔出硬脊膜穿刺针内塞，放入腰麻针用100 μl 微量移液器依动物分组各注射携带 hIGF-1 基因的腺病毒载体（滴度为80×109 PFU/L） 、hIGF-1 生长因子（100 μg/L)、PBS，注入容量为 25 μl。

分别于注射后 1、2、4、8 周，各组实验动物均取 2 只，动物麻醉后，穿刺耳缘静脉注入 10 ml 空气致死迅速切取腰椎全段，切除椎板及附着肌肉，分别切取L4、5、L5、6 椎间盘，去除上下软骨终板，仅保留完整的纤维环、髓核组织1.2.3 Western blot 检测 hIGF-1 蛋白表达1.2.3.1 组织总蛋白质提取及浓度测定（1）组织剪碎：于 0 ℃以 PBS 充分洗涤组织碎片，4 ℃ 3 000 r/min 离心 5 min，估算离心管底部沉淀物体积；吸出上清液 （2）以 5 倍体积预冷的悬浮缓冲液分散组织碎片，尽快加入等体积的 2×SDS 凝胶加样缓冲液 （3）将样品置于沸水浴中加热 10 min，采用带有浸入尖。