细胞间灭菌.docx

一、无菌室无菌室是为无菌操作而设计的空间，包括操作间和缓冲间操作间又可 分为细胞室和感染室缓冲间能保护无菌间的无菌环境，可兼有更换无菌衣 帽和进行一些简单操作（如放孵育箱、离心等）的功能使用无菌室时应按以下顺序：① 熟悉实验计划，备齐必要的材料和器具，杜绝实验过程中反复出入 无菌室无菌室2-3天消毒① 清水擦拭② 新洁尔灭水擦拭② 穿戴无菌衣帽和口罩③ 打开杀菌灯，灭菌30分钟，关闭杀菌灯，通风20分钟以上方可打 开日光灯，方可进入通过一定路线拿入必要物品（应尽量减少出入的次数）④ 手部消毒后再进行实验操作⑤ 完成实验后将用完物品移出实验台，废物移出实验室，废液缸洗刷 完毕，重新放入培养间⑥ 擦净实验台打开实验台灭菌灯灭菌30分钟，，退出后打开实验室灭 菌灯灭菌30分钟，关闭杀菌灯★ ★紫外产生的臭氧具有灭菌 作用，而臭氧在日光灯下易 分解失效，所以开紫外不要 开日光灯，且紫外关闭20 分钟内排风阶段也不要开 日光灯二、超净台（净化台）超净台比较密闭，分垂直流和侧流式，外界空气通过滤器从上面、侧面 或正面流入操作箱内，并能形成气流屏障，以保持台面无菌生物安全柜为 外排型① 打开实验台灭菌灯灭菌30分钟，启动风机10min后打开前面玻璃操 作窗，消毒手部后即可进行无菌操作。

超净台日常消毒① 清水擦拭② 75%酒精擦拭② 工作结束时清理实验台台面，关闭操作窗，关闭日光灯，打开实验 台紫外灯30分钟进行消毒超净台应为一般实验室必备的设施，尤其用培 养细胞进行连续形态学和生化学实验时更为方便，效果如同在无菌室内三、培养箱① 取下培养箱内的隔板及挂钩，用清水清洗干净后，75%酒精彻底擦洗消 毒（水盘消毒的法子：清水清洗干净，75%酒精彻底擦洗消毒后，多弄 些酒精上去，点火烧一下）2, 培养箱用清水擦洗干净后用75%酒精彻底擦洗消毒3, 带无菌手套，安装好培养箱内的隔板及挂钩4, 打开培养箱紫外灯照射30分钟5, 高压蒸馏水后加入二、细胞的复苏细胞复苏指按一定的复温速度将冻存的细胞恢复到常温当恢复到 常温状态时，冻存细胞的形态结构保持正常，代谢反应即可恢复一）方法1. 取出冻存管，立即放入37〜40°C水浴中，快速摇晃直至完全融 化（应在lmin内完成）（我们采用38度）2. 离心管中加入5ml左右培养液，无菌操作打开冻存管，将细胞悬 液吸到离心管中，离心细胞（1000r/min, 5min）后，弃上清用少量生 长液悬浮细胞，转入培养瓶中配成所需要的细胞浓度，置5%CO2孵箱（37°C）中培养。

4〜6h后，待细胞贴壁，轻轻倒掉含冻存液的生长液， 换生长液后继续培养二）注意事项1. 应在1min内使冻存细胞完全融化复温速度太慢会造成细胞损 伤2. 复苏过程中应戴手套和护目镜冻存管可能涌入液氮，解冻时冻 存管内的气温急剧上升，可导致爆炸，应予以注意三、细胞的运输在购买和交换培养细胞时，需根据保存方式和运输时间，采用适当 的运输方法一）充液法运输1 .选生长良好的细胞，待接近或刚刚连接成片后，去掉培养液，加 入新鲜培养液至培养瓶颈部（保留少量空气），拧紧瓶盖，然后用胶带将 瓶口密封2.到达目的地后，弃去多余培养液，置37r培养，次日传代二）冰瓶运输在较短时间内运输细胞，可将未冷冻的细胞悬液放入装有碎冰的冰 瓶内，以保持细胞活力三）液氧罐运输细胞冻存后，将有细胞的冻存管放入液氮罐内进行运输在液氮罐 搬运过程中，要防止液氮外漏。