南医大药物分析第15章 甾体激素类药物分析2015年.ppt

《药物分析》 第十五章,甾体激素类药物的分析,药学院药物分析系 郑艳洁,古人提炼秋石—古之春药 观察时代,甾体激素的发展,布特南德-1929年提取纯净雌酮 化学时代,明代宦官塑像,基本结构：环戊烷并多氢菲,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,田,巛,环上双键的表示方法： 用“”表示 ,双键的位置写在的右上角双键位置,4,1,4,5,5(10),分类：,甾体激素,肾上腺皮质激素,性激素,雄性激素及蛋白同化激素,孕激素,雌性激素,,,,皮质酮的衍生物,肾上腺皮质激素,,,,还原性,,UV、与羰基试剂反应,氢化可的松（天然型）,肾上腺皮质激素,醋酸地塞米松,,,,肾上腺皮质激素,泼尼松,,,肾上腺皮质激素,雄性激素,甲睾酮,,,,UV、与羰基试剂反应,可成酯,,丙酸睾酮,,,雄性激素,,,,蛋白同化激素,苯丙酸诺龙,,,孕激素,黄体酮,UV、与羰基试剂反应,,可与亚硝基 铁氰化钠反应(专属鉴别),,雌二醇,,,雌性激素,,UV、与重氮苯磺酸盐反应,炔雌醇,,,,可与硝酸银反应,雌性激素,,,,它属于什么类型的激素？,左炔诺孕酮,Answer：睾酮类强效孕激素,米非司酮（孕激素受体拮抗剂）,知识拓展：,用途：与前列腺素醇合用,→,碱性（高氯酸滴定）,药流,,,一、结构与性质,1. 肾上腺皮质激素,2. 雄性激素及蛋白同化激素,3. 孕激素,4. 雌激素,二、鉴别试验,（一）物理常数的测定,1、熔点 2、比旋度 3、吸收系数,（二）与强酸的呈色反应,甾体激素类药物,呈色,,H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl,（母核）,与硫酸显色反应,显 色 荧光 加水稀释,,,,,,泼尼松龙 深红 絮状↓灰,泼尼松 橙 黄→蓝绿,炔雌醚 橙红 黄绿 ↓红色,炔雌醇 橙红 黄绿 絮状↓玫红,醋酸可的松 黄或微 褪色并澄 带橙 清,（三） 官能团的反应,1、C17 – α – 醇酮基,有强还原性，与氧化剂作用，被氧化成水合醛。

三） 官能团的反应,肾上腺皮质激素药物,呈色,,四氮唑盐 OHˉ,1、C17 – α – 醇酮基,还原性,A. 呈色反应,肾上腺皮质激素药物,Cu2O↓橙红色,,碱性 酒石酸铜,B. 沉淀反应,Ag↓黑色,,氨制硝酸银,,甾酮类激素药物,呈色,,羰基试剂,2. C3–酮基和C20–酮基,＃常用的羰基试剂： 2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼,异烟腙（黄色）,睾酮,黄体酮,异烟双腙（黄色）,具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物,呈色,,亚硝基铁氰化钠 间二硝基酚 芳香醛,3. 甲酮基,黄体酮,蓝紫色,,亚硝基铁 氰化钠,其他甾体,,,淡橙色 不显色,黄体酮,蓝紫色,活泼亚甲基反应（Zimmermann 反应）,,羰基邻位的亚甲基叫活泼次甲基羰 基 C3、C11、C20 亚甲基C2、C12、C21,,羰基 C17 亚甲基C16,,有机氟,Fˉ,,有机破坏,有机氯,,,Clˉ,4. 有机卤素,,茜素氟蓝 硝酸亚铈,硝酸—硝酸银,,AgCl↓,呈色,茜素氟蓝,蓝紫色,,F-,雌激素类药物,红色偶 氮染料,,重氮苯磺酸,5. 酚羟基,含炔基的甾体激素,银盐沉淀,,硝酸银,6. 乙炔基,,↓,炔雌醇,,白,,香,（四）水解产物的反应,,特臭,特臭,△４-3-酮 240nm,苯环 280nm,（五） UV法,醋酸甲地孕酮(288nm),3300～3000cm-1,3000～2700cm-1,1900～1650cm-1,1650～1450cm-1,1000～650cm-1,（七） IR法,3750～3300cm-1,ν,醋酸可的松,结构特征：△4–3–酮、C17 –OH C20 –酮基、 C11 –酮基、醋酸酯,1630cm-1,ν,3420cm-1,,亚甲基、角甲基吸收带,1750cm-1,1232cm-1,1052cm-1,结构特征：△4–3–酮、C17 –OH C17–乙炔基,炔诺酮,H,1650cm-1,ν,3300cm-,3270cm-1,ν,1615cm-1,结构特征：酚羟基、C17 –OH C17 –乙炔基,炔雌醇,1505cm-1,ν,3505cm-1,3300cm-1,ν,1590cm-1,3610cm-1,ν,酚羟基,醇羟基,1615cm-1,苯环的骨架振动,（八） TLC法,主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别,方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。

九） HPLC法,主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）,方法：对照品法 要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致三、 杂质检查,（一）有关物质,定义 与标示药物结构不同的甾体化合物都称为“有关物质”,,Li/NH3 C2H5OH,,弱酸,雌二醇－3－甲醚,苯丙酸诺龙的合成路线,I,II,,,强酸,苯丙酰氯,HCl,III,特点 （1）可能存在多个甾体杂质 （2）结构类似,2. 来源 原料、中间体、异构体、降解产物,4. 方法（具有一定分离能力） TLC法（高低浓度对比法） HPLC法（类似高低浓度对比法）,（1）TLC法（高低浓度对比法）,判定方法： 规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色,醋酸去氧皮质酮 检查 有关物质,取本品加氯仿-甲醇（9 ：1）制成10mg/ml作为供试液，精密量取适量，加上述溶剂稀释成0.1mg/ml作为对照液（1）与0.2mg/ml的对照液（2） ；照薄层色谱法，各取5μl，分别点于同一硅胶GF254板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水（77:15:8:1.2）为展开剂，展开后晾干，在紫外光灯（254nm）下检视。

供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液（1）所显的主斑点比较，不得更深，如有1个斑点深于对照溶液（1）的主斑点，与对照液（2）所显的主斑点比较，不得更深特点： （1）简便易行，不需特殊的仪器； （2）不需对照品； （3）只能控制单个杂质的限量； （4）要求杂质与主成分的显色灵敏度接近2）HPLC法（高低浓度对比法）,判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积,醋酸可的松 检查 其他甾体,特点： （1）需特殊的仪器； （2）不需对照品； （3）可以控制杂质的总量；,（二）游离磷酸,地塞米松磷酸钠 氢化可的松磷酸钠 倍他米松磷酸钠 氢化泼尼松磷酸钠,对照品法,原理：,方法：,检查 游离磷酸,地塞米松磷酸钠,精密称取本品20mg，置25ml量瓶 中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫 酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶 液1ml，加水至刻度，摇匀，在20℃放 置30～50分钟，照分光光度法，在740 nm处测定吸收度，与对照液4.0ml同法 处理的吸收度比较，不得更大对照液 0.0035%KH2PO4）,（三）甲醇和丙酮,甲醇 ≤0.3%,丙酮 ≤0.5% 内标法 + 校正因子,GC法,四、硒,来源 合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢,剧毒,,原理,,方法,规定 A供＜A对。

测定对象：醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、曲安奈得、醋酸曲安奈得等,四、含量测定,（一）UV法,△４-3-酮 240nm（±）,肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素,苯环 280nm（±）,雌激素,,（二）反应分光光度法（比色法）,1. 适用于非（弱）分光光度活性药物 2. 使待测组分光谱位移，避免干扰，提高选择性 3. 提高测定灵敏度,弱、非分光光度活性药物,,强分光光度活性药物,化学反应,肾上腺皮质激素类,C17 -α－醇酮基,强还原性,1. 原理,四氮唑比色法,[O],,OH-,分子重排,三苯甲瓒↓深红,,,蓝四氮唑（BT）,,,双甲瓒（暗蓝）,2. 方法,ChP TTC（RT） BP TTC（RT） USP BT,对照品法,醋酸泼尼松龙软膏 含量测定 对照液：精密称取醋酸泼尼松龙对照品 20mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇振 摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得 供试液：精密称取本品4g（约相当于醋 酸泼尼松龙20mg），置烧杯中，加无水 乙醇约30ml，置水浴上加热，充分搅拌， 使醋酸泼尼松龙溶解，再置冰浴中冷却， 滤过，滤液置100ml量瓶中，同法提取,三次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀 释至刻度，摇匀，即得。

测定法：精密量取上述溶液各1ml，分 别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙 醇9ml与氯化三苯四氮唑试液2ml，摇匀， 再各精密加氢氧化四甲基铵试液1ml， 摇匀，在25℃暗处放置40～50分钟，照 分光光度法，在485nm的波长处分别测 定吸收度，计算，即得操作应避光3. 讨论,（1） 基团对反应速度的影响,C11= O＞ C11－OH,C21－OH＞ C21-酯,C16无论何种取代基ν↓,（2） 溶剂、水分的影响,含水量＞5%→ν↓,含水10%→A↓10% 含水30%→几无反应,,— 无水乙醇,还原性,（3） O2与光线的影响,反应过程 反应产物,怕光,→避光、快速,,O2影响颜色强度和稳定性,→隔绝空气、 快速、充N2,（4）碱的种类及加入顺序,反应应在强碱性（pH13.75） 条件下进行 以氢氧化四甲基铵的结果最佳,加入顺序：,避免皮质激素分解,（5） 温度与时间,t℃↑→ν↑→甲瓒分解↑→%↓,4. 特点： 缺点 影响因素太多 优点 测定结果能指示药品 的稳定性（氧化及降 解产物无此反应）,肾上腺皮质激素、 雄性激素和蛋白同 化激素、孕激素,C3－酮基,1. 原理,异烟腙（黄色）,3.讨论,(1)反应速度,C3= O ＞ C17= O 、 C20= O C11= O 不反应,反应专属性 C3－酮基,（2）溶剂的选择,异烟肼盐酸盐→甲醇、乙醇,无水甲醇 无水乙醇-植物油存在时,,（3）水分、O2与光线的影响,含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓,不挥发溶剂、不吸收水分时→ O2与光线无影响,酸、异烟肼的量,(4),盐酸 : 异烟肼 = 2 : 1,样品 : 异烟肼 = 1 : 8 →ν↑,t℃ ↑ → ν↑,*该法由于影响因素多，已被HPLC法取代,1. 原理,雌激素,,雌二醇-3-甲醚,,λmax=465,λmax=515,,,,Kober反应缺点： （1）条件较难控制，易出双色→黄+红 （2）重现性较差： ① 呈色强度和稳定性受试剂浓度、组成、反应时间和温度的影响。

② 甾体激素提取物中其他物质及制剂中稳定剂、赋形剂、溶剂对测定有干扰[(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚],Iron-phenol Reagent,浓硫酸和过氧化氢的作用： 浓硫酸和过氧化氢将2价铁氧化成3价铁,[(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚],Iron-phenol Reagent,2. 特点： 优点 较高的灵敏度 具有一定的选择性 缺点 非化学计量反应 反应应控制条件、 注意平行原则,USP、BP、JP均采用,RP－HPLC（大多内标法）,特点 用样量少，灵敏度高，分离效 果好，测定速度快,（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰）,应用示例-1,氢化可的松 鉴别: （1）取本品约0.1mg，加乙醇1ml溶解后，加临用新制的硫酸苯肼试液8ml，在70℃加热15分钟，即显黄色 （2）取本品约2mg，加硫酸2ml使溶解，放置5分钟，显棕黄色至红色，并显绿色荧光；将此溶液倾入10ml水中，即变成黄色至橙黄色，并微带绿色荧光，同时生成少量絮状沉淀 （3）本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱（光谱集283图）一致。