2020年医学论文甘油磷酸胆碱层析纯化及稳定性研究.doc

医学论文甘油磷酸胆碱层析纯化及稳定性研究 　　 　　甘油磷酸胆碱(GlycerophosphatidylcholineGPCalpha．GPC)是脂磷脂酰胆碱(PC)分子上的两个脂肪酰基完全被水解掉的产物药物代谢动力学表明：PC被吸收进入血液循环分布在各器官它也是人体内分泌代谢的水溶性小分子物质能通过血脑屏障为重要的神经传递质乙酰胆碱(Acetyl—choline)的生物合成前体根据“胆碱能损伤假说”老年痴呆症的发病机制(记忆力、认知障碍等)与神经递质乙酰胆碱水平降低密切相关如果提高脑内乙酰胆碱水平可以显著改善老年痴呆患者认识功能损伤的症状有专利报道了甘油磷酸胆碱和茴拉西坦同时服用可以治疗阿尔茨海默氏症临床研究表明：GPC治疗脑缺血性中风、阿尔茨海默氏症、多发性脑梗死型痴呆疗效显著临床用于改善中毒性肝损伤等保肝作用；同时GPC还具有显著的防衰老、降血脂、健脑等多种功效作为保健品及药物制剂的研究与应用正越来越受到重视GPC已经在意大利、波兰、韩国、俄罗斯、希腊、智利、巴西等国家上市可在我国还处于研发阶段本试验采用三氧化二铝脱色法和硅胶柱层析法相结合的工艺对甘油磷酸胆碱进行分离纯化并采用高效液相色谱法对其在强光照射、高温、高湿等条件下的稳定性进行研究从而为其生产、包装、贮存、制剂研发等提供科学依据 　　 　　1仪器与试药 　　 　　1．1主要仪器上海民桥精密科学仪器有限公司SL202N型电子天平；长沙湘仪离心机有限公司TGI6一WS台式高速离心机；江苏金坛晶玻实验仪器厂HH一2型恒温水浴锅；美国ALLTECH2000蒸发光散射检测器配备单岛津液相LC一10ATVP输液泵六通阀手动进样浙江大学N2000色谱工作站 　　 　　1．2主要试药GPC粗品由合肥工业大学医学工程学院实验室酶法生产；GPC对照品从意大利Euti．calsS．pA公司购买；GPC产品(批号为100301100302100303)由本实验室分离纯化制得无水乙醇、甲醇、二氯甲烷均为天津四友公司生产的分析纯试剂乙腈为天津四友公司生产的色谱纯试剂所用水为超纯水机制备的去离子水；三氧化二铝和硅胶粉均为100—200目由国药集团生产 　　 　　2方法与结果 　　 　　2．1甘油磷酸胆碱的层析纯化 　　 　　2．1．1三氧化二铝和硅胶粉的预处理三氧化二铝的预处理：将三氧化二铝平铺在容器中于25O℃的烘箱中烘烤4h待用；硅胶粉的预处理：将硅胶粉平铺在容器中于105℃的烘箱中烘烤30min待用 　　 　　2．1．2三氧化二铝对甘油磷酸胆碱粗品脱色选择甘油磷酸胆碱与三氧化二铝的质量比为1：10 　　 　　在烧杯中称取实验室制备的甘油磷酸胆碱约10g加入无水乙醇约100mL置于50℃的恒温水浴锅中保温搅拌使得甘油磷酸胆碱完全溶解后加入约100g经过预处理的三氧化二铝搅拌脱色2h离心分离除去下层三氧化二铝将上层溶液蒸发浓缩除去溶剂得到塑黄色的甘油磷酸胆碱4．2g 　　 　　2．1．3硅胶柱层析法进一步纯化甘油磷酸胆碱称取约210g经过预处理的硅胶粉用甲醇溶胀24h后湿法装柱将经过三氧化二铝脱色的4．2g甘油磷酸胆碱产品溶于少量乙醇中小心的加入层析柱内缓慢的加入洗脱剂(甲醇：乙醇：氯仿=60：35：15)进行洗脱分段收集柱下端流出的洗脱液检测合并含有甘油磷酸胆碱的洗脱液蒸发浓缩除去溶剂得到甘油磷酸胆碱产品 　　 　　2．2甘油磷酸胆碱的含量测定及稳定性研究 　　 　　2．2．1对照品溶液的制备精密称取意大利Euti．calsS．pA公司的GPC对照品适量用流动相溶解后转移至100mL容量瓶中定容得到约10g·L的储备液冰箱保存备用 　　 　　2．2．2色谱条件浙江大学N2000工作站色谱柱为GraceSmartRP8柱(250mm×4．6Bin5I,zm)流动相为60％乙腈一水溶液流速为0．7mL·min～柱温为(2541)qC检测器为美国All—tech2000型蒸发光散射检测器漂移管温度为109％载气为空气气体流速为3．5mL·min进样量为20L 　　 　　2．2．3标准曲线的测定分别精密吸取GPC对照品储备液1、2、3、5、10、20mL置于100mL容量瓶中用流动相定容后摇匀精密量取20L进样记录色谱峰面积对进样浓度(mg·L)和峰面积分别取对数然后以浓度的对数lnC对甘油磷酸胆碱峰面积的对数y进行线性回归求得标准曲线方程为：Y=0．5381lnC一8．722R=0．999线性范围为100—2000mg·L～实验结果见图1 　　 　　通过图1可以看出硅胶柱层析后GPC在图谱上表现为单峰无论是从外观上还是从HPLC谱图上分析都可以得出结论：通过硅胶柱层析能够得到GPC纯品 　　 　　2．2．4样品含量测定方法精密称取经过分离纯化的GPC适量用流动相溶解后转移至100mL容量瓶中定容得到约10g·L的溶液精密量取该溶液5mL置于100mL容量瓶中用流动相定容至刻度摇匀精密量取20L进样记录色谱峰面积并采用外标两点对数法计算样品含量 　　 　　2．2．5回收率试验分别精密吸取对照品储备液3、10mL置于100mL容量瓶中用流动相定容后摇匀作为对照品溶液精密称取分离纯化的GPC(批号100301)适量用流动相溶解分别制成约含GPC0．4、0．5、0．6g·L的溶液各3份精密量取20L进样记录色谱峰面积采用外标两点对数法计算含量并求得回收率 　　 　　平均回收率为99．81％；RSD=0．85％(n=9) 　　 　　2．2．6精密度试验对照品溶液取“2．2．5”项下的对照品溶液精密称取分离纯化的GPC产品(批号100301)适量用流动相溶解制成约含GPC0．5g·L的溶液精密量取20L进样进样6次记录色谱峰面积采用外标两点对数法计算样品含量并计算相对标准偏差结果测得GPC的含量分另0为：99．02％、99．67％、100．14％、100．18％、99．28％、99．95％平均含量为99．7l％RSD=0．48％(n=6) 　　 　　2．2．7强光照射试验取分离纯化的GPC(批号100301)3份编号为100301—1、100301—2、100301—3分别平铺在培养皿中使其厚度≤5mm置于澄明度测定仪下(光线强度为4500LX)10d于第5、10天取样与第0天的含量比较考察其含量变化平均含量为99．51％；RSD=0．40％(凡=9)结果表明含量无明显变化即GPC对光比较稳定 　　 　　2．2．8高温试验取分离纯化的GPC(批号100301)3份编号为100301—1、100301—2、100301—3分别平铺在培养皿中使其厚度≤5mm在60℃下放置10d于第5、1O天取样与第0天的含量比较考察其含量变化计算平均含量为99．65％RSD为0．42％(n=9)结果说明含量无明显变化表明GPC原料药对热比较稳定 　　 　　2．2．9高湿试验取分离纯化的GPC(批号100301)三份编号为100301—1、100301—2、100301—3分别平铺在培养皿中使其厚度≤5mm在25℃于相对湿度75％条件下放置10d于第5、l0天取样与第0天的含量比较考察其含量变化试验结果：平均含量为99．30％RSD为0．47％(n=9)表明GPC对湿比较稳定 　　 　　2．2．1O加速试验分别取GPC(批号为100301、100302、100303)各一份在密闭器皿中于40~C、相对湿度75％的条件下放置6个月于第1、2、3、6个月月末取样与第0个月的含量比较考察其含量的变化计算含量平均值为99．6l％RSD为0．57％(n=15)结果含量无明显变化表明GPC比较稳定试验结果见表5 　　 　　2．2．11长期试验分别取GPC(批号为100301、100302、100303)各一份在密闭器皿中于25℃相对湿度60％的条件下放置12个月于第3、6、9、12个月月末取样与第0个月的含量比较考察其含量的变化平均含量为99．12％RSD为0．50％(t=15)即含量无明显变化表明GPC化学性质和物理性质比较稳定试验结果见表6 　　 　　2．2．12重复性试验取配制5份浓度为0．5g·L的GPC供试品溶液按“2．2．4”项下色谱条件进行测定按照上述含量测定方法测得5份GPC供试品的含量分别为99．83％、100．11％、99．92％、98．57％、99．98％计算RSD为0．63％结果表明本法测定的重复性良好 　　 　　3讨论试验结果表明通过三氧化二铝脱色法和硅胶柱层析法相结合的工艺对甘油磷酸胆碱进行分离纯化能够得到含量达99．5％以上的产品该分离纯化工艺简单可操作性强适用于工业化生产 　　 　　采用美国Alltech2000型蒸发光散射检测器使用高效液相色谱法研究甘油磷酸胆碱的稳定性根据检测结果GPC色谱峰的理论塔板数均在3000以上 　　 　　该方法灵敏、准确、重现性好通过影响因素试验、加速试验和长期试验考察后甘油磷酸胆碱的性状没有发生明显改变且产品的各项指标均符合中国药典版的规定产品的稳定性良好 　　 　　实事上甘油磷酸胆碱在意大利LPB公司上市临床应用多年I临床效果显著流行病学调查n我国老年痴呆患者约600万左右目前尚无特效治疗药物研发治疗相关疾病新药是当务之急根据国家FDA新药标准甘油磷酸胆碱可以做为“只要该活性成分未被批准上市”新药研究开发有关研究表明新化学实体研发失败的原因主要归结为以下3个方面：安全性、有效性和经济性本实验室对以大豆磷脂为原料制备甘油磷酸胆碱进行了深入研究采用非水相生物催化制备甘油磷酸胆碱生物催化反应所用试剂毒性小且有高度专一性且不改变卵磷脂的天然结构反应条件温和该工艺经济、安全、环保适合工业化生产 　　 　　进一步对甘油磷酸胆碱的鉴别和含量测定方法进行了探索采用化学鉴别法、薄层色谱鉴别法、HPLC鉴别法和红外色谱图鉴别法能够简便、可靠、、有效地对甘油磷酸胆碱进行鉴别所采用的HPLC—ELSD含量检测法专属性强、重现性高可作为三类新药GPC的含量标准控制 　　 　　综上所述本实验室以大豆磷脂为原料采用科学、先进的酶法制备和纯化GPC的工艺使产品质量达到申报国家新药的质量标准在强光照射、高温、高湿等条件下的稳定性研究结果表明甘油磷酸胆碱的物理性质和化学性质比较稳定从而为其生产、包装、贮存、制剂研发等提供了科学依据 　　   。