实时荧光定量pcr技术 lyz.pptx

Real-time qPCR,实时荧光定量PCR技术,Yuanze. L，SOOCHOW UNIVERSITY Mob： 13405053822 E-mail： liuleirun@,1,提 要,PCR 技术：,实时荧光定量PCR技术 :,1. 定 义,2. 比较：荧光PCR和普通PCR,3. 基本原理 — 四个重要概念,4. 基本原理 — 定量原理,5. 基本原理 — 常用的荧光标记方法,6. 主要仪器类型,基本原理 / 体系成分 / 反应参数,2,PCR, Polymerase Chain Reaction, 聚合酶链式反应，聚合酶连锁反应,3,PCR 基本原理：,1/ 类似体内DNA复制(合成双链DNA）— DNA聚合酶,2/ 核酸的热变性和复性,3/ 指数扩增 雪崩效应,CSH Flash：PCR,CSH 3D：01-rep,4,Template: DNA模板 Primer: 引物 Buffer: 反应缓冲液 dNTP mix: 脱氧核糖核苷三磷酸 ddH2O: 双蒸水 Thermus aquaticus DNA polymerase: 耐热DNA聚合酶,PCR 体系成分：,5,6,,PCR 反应参数：,变性：预变性 — 第1个循环前，94 ℃，5-10 min， 重要, 使模板 DNA 完全解链 变性 — 94 ℃，1 min， 高GC 序列需适当提高变性温度，但温度过高或时间过长都会导致酶活性损失 退火：理想状态下，退火温度足够低，保证引物同目的序列有效退火；同时还要足够高，以减少非特异性结合 合理的退火温度— 55 ℃~70 ℃，30 ~ 60 sec 延伸：通常为 72 ℃ — 接近 Taq DNA 聚合酶的最适反应温度 75 ℃ 延伸时间的长短取决于目的序列的长度和浓度，一般反应体系中,Taq DNA 聚合酶 1kb DNA / min 终延伸 — 72 ℃，10 min , 获得尽可能完整的产物 循环次数：其它参数确定之后, 循环次数主要取决于 DNA 浓度。

一般而言 25-30 轮循环已经足够,7,,,,8,实时荧光定量PCR技术,9,1. 定 义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，最后通过观察扩增曲线对扩增反应定性分析以及通过一定方法对未知模板进行绝对定量和相对定量的方法10,2. 定量角度比较：荧光PCR和普通PCR技术,荧光PCR： 利用荧光信号的变化实时检测扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值的分析对起始模板进行定量分析，更真实，更有意义起点定量，初始模板量）,普通PCR： 对PCR扩增反应的终点产物进行定性和定量分析，扩增后用电泳方法分析 （终点定量，产物量）,,,11,1/ 扩增曲线,扩增曲线：PCR过程中实时反映荧光强度信号变化情况的一条曲线,横坐标：扩增循环数；纵坐标：荧光强度（每个循环进行一次荧光信号的收集）,3. 基本原理：四个重要概念,12,线性扩增曲线呈现“S”型，分为四个阶段： 从PCR反应动力学过程角度，可以视作引物、模板、酶三者的随机碰撞 基线期：反应初期，模板的量很小，所以三者碰撞的概率接近0； 指数增长期：随着循环数的增加，累积了足够的碰撞后， 反应进入指数扩增（线性增长期）； 平台期：随着引物渐渐消耗，三者的碰撞概率又趋于0，并且伴随着酶反应活性的下降，扩增进入平台期。

13,2/ 基线,基线：即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增曲线的水平部分,14,3/ 阈值,手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段阈值线,15,4/ Ct值 — 扩增曲线分析和起点定量的关键：,Ct值：荧光信号有统计学意义显著增长(进入指数期穿过阈值线)时所对应的循环次数Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性起点定量大大优于终点定量16,4. 基本原理 — 定量原理,log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M,（利用Ct 值定起始模板量的依据）,log起始浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到阈值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量模板起始浓度越高，Ct值越小X0：初始模板量 „ Ex：扩增效率,17,5. 基本原理 — 常用的荧光标记方法,非特异性荧光标记：染料直接结合扩增产物,特异性荧光标记：标记探针,SYBR Green I (DNA双链染料）,TaqMan （水解型杂交探针）,Molecular Beacon（分子信标）,Amplisensor（复合探针技术）,18,1/ SYBR Green I 荧光染料,工作原理： SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光,19,SYBR Green I 工作原理,,,Extension,Extension Continued Apply Excitation Wavelength,,Repeat,20,2/ Taqman 水解型杂交探针,21,d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase,Primers,Add Master Mix and Sample,Denaturation,,Annealing,Reaction Tube,,TaqMan工作原理,22,,,Extension Step,1. Strand Displacement,2. Cleavage,3. Polymerization Complete,4. Detection,l,,,,TaqMan工作原理,23,3/ Molecular Beacon 分子信标,发夹型杂交探针,茎,环,荧光素,淬灭剂,工作原理：荧光偏振能量传递（FRET）,茎 由互补配对的序列组成,环 与目标序列完全配对,24,变性时: 产生非特异性的荧光,退火时: 探针与靶序列结合； 荧光素与淬灭剂分离——发出荧光（靶序列特异的）；,延伸时: 没有荧光,25,26,荧光信号的产生,荧光基团在激发光作用下，产生波长更长的发射光,27,“实时PCR”指不开盖测定核酸,1/ 闭管化学(污染的风险低) 2/ 没有PCR后处理(无需走胶、拍照等) 3/ 高度自动化 4/ 定性：单数据点测定 定量：多数据点测定 5/ 能做基因分型及SNP鉴定,28,6. 主要仪器类型,29,ABI Real-Time PCR Instruments: L, 2013-01-24,http://www.bio- L, 2013-01-24, for your attention！,33,。