脑心同治理论与丹红注射液研究万海同.4.25 ppt课件.ppt

•脑心脑心同治理论与丹红注射液同治理论与丹红注射液•对脑缺血性损伤保护机制研究对脑缺血性损伤保护机制研究• •浙江中医药大学浙江中医药大学 万海同万海同 教授教授•2015.4.252015.4.252015.4.252015.4.25万海同 二级教授 首席教授 博导 所长 院长 •国家百千万人才工程专家国家百千万人才工程专家•享受国务院政府津贴人员享受国务院政府津贴人员•国家中医药管理局国家中医药管理局““十二五十二五””重点学科（中医工程学）重点学科（中医工程学） 带头人带头人•国家中医药管理局中医临床基础重点学科国家中医药管理局中医临床基础重点学科 带头人带头人•浙江省高校脑血管病创新团队浙江省高校脑血管病创新团队 负责人负责人•浙江省中西医结合学会脑心同治专业委员会浙江省中西医结合学会脑心同治专业委员会 主任委员主任委员•浙江省中西医结合脑病重点学科浙江省中西医结合脑病重点学科 负责人负责人•浙江中医药大学心脑血管疾病研究所浙江中医药大学心脑血管疾病研究所 所长所长•浙江中医药大学生物工程学院浙江中医药大学生物工程学院 院长院长•浙江省中医药重点学科（中药药物代谢动力学）浙江省中医药重点学科（中药药物代谢动力学） 带头人带头人•中华中医药学会中药制剂分会中华中医药学会中药制剂分会 副主任副主任• 主要内容三三• •丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究二二• •脑心同治理论脑心同治理论脑心同治理论脑心同治理论一一心脑血管疾病的防治现状心脑血管疾病的防治现状• 第一部分第一部分 心脑血管疾病的防治现状心脑血管疾病的防治现状一、心一、心脑血管病是一复杂、难治性疾病，对人类危害严重脑血管病是一复杂、难治性疾病，对人类危害严重防治脑病已成为社会和医学界广泛关注的重要课题防治脑病已成为社会和医学界广泛关注的重要课题死亡率居高不下死亡率居高不下世界范围世界范围： 死于心脑血管病死于心脑血管病1500万人万人/年；年； 占全球死亡人数的占全球死亡人数的三分之一至二分之一；三分之一至二分之一； 是危害人类最大疾病是危害人类最大疾病。

　　中国：中国：死于心脑血管病死于心脑血管病每天有每天有7000人，人，每每12秒钟就有秒钟就有1人；人；首次发年龄，首次发年龄，30%以以上在上在60岁之前 我国心脑血管疾病患者已经超过我国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人！亿人！我国每年死于心脑血管疾病我国每年死于心脑血管疾病300万人！万人！•幸存下来的患者：幸存下来的患者：•75%不同程度不同程度丧失丧失劳动能力；劳动能力；•50%以上的以上的脑血管脑血管意外意外幸存者生活不幸存者生活不能完全自理；能完全自理；•40%重残•我国我国脑中风脑中风病人出院病人出院后第一年的复发率是后第一年的复发率是30%，第五年的复发，第五年的复发率高达率高达59%；；•而二级预防做得较好而二级预防做得较好的的美国仅为美国仅为10%各种危险因素居高不下各种危险因素居高不下中国目前总共有：1.6亿高血压患者；亿高血压患者；6000万糖尿病患者；万糖尿病患者；1.6亿人群血脂异常；亿人群血脂异常；2亿人体重超标；亿人体重超标；6000万人肥胖；万人肥胖；还有大量烟民、酒客还有大量烟民、酒客更令人忧虑：更令人忧虑：城乡差别不大；城乡差别不大；中年人与老年人中年人与老年人患病率接近；患病率接近；中风与心肌梗塞、中风与心肌梗塞、心力衰竭常伴随发心力衰竭常伴随发生。

生 二、抗血栓治疗成为西医学治疗动脉粥样硬化、冠心病、脑梗死治疗的重要基石• 随着心脑缺血性血管疾病发生率增加，越来越多患者需要长期应用抗血栓药物，临床常用抗凝药物为华法林，抗血栓药物多为氯吡格雷及阿司匹林等•尤其是抗血小板聚集药已成为心脑血管疾病常规治疗 三、西医学对脑梗死内科治疗仍是抗栓、溶栓等，有一定疗效，但也有并发症等 溶栓溶栓 降纤降纤 血栓、栓子血栓、栓子 血管堵塞血管堵塞 缺血损伤缺血损伤 抗血栓抗血栓 迅速复流迅速复流 脑保护脑保护 减慢缺血级联反应减慢缺血级联反应 限制再损伤限制再损伤 易致易致出血性梗死出血性梗死 并发症并发症 再闭塞再闭塞 不足之处不足之处 不能改善不能改善 半暗区血供半暗区血供抗血小板药物作用机制图偱证医学新证据表明： 抗血栓西药疗效欠佳，并认为抗血小板西药是一把双刃剑：在降低心抗血栓西药疗效欠佳，并认为抗血小板西药是一把双刃剑：在降低心脑血管不良事件的同时，许多抗血小板聚集西药也带来了出血并发症。

脑血管不良事件的同时，许多抗血小板聚集西药也带来了出血并发症抗血栓药物主要分：抗血小板聚集药、抗凝血药、溶血栓药主要副作用：口服抗血栓药物引起颅内出血的发生率在9-13％，死亡率超过50％抗凝溶栓对已形成血栓无直接溶栓作用，且溶栓易致出血性梗死(脑出血6.4%-19.8%，脑死亡率50%）和再闭塞等危险阿司匹林药物抵抗率达5.5%-61%药药物种物种物种物种类类药药物物物物作用机制作用机制作用机制作用机制试验试验状况状况状况状况谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸钠钠拮抗拮抗拮抗拮抗剂剂CGS 19755CGS 19755CGS 19755CGS 19755竞竞争性争性争性争性NMDANMDANMDANMDA拮抗拮抗拮抗拮抗剂剂三期三期三期三期无效无效无效无效YM-872YM-872YM-872YM-872AMPAAMPAAMPAAMPA受体拮抗受体拮抗受体拮抗受体拮抗剂剂三期三期三期三期无效无效无效无效ApiganelApiganelApiganelApiganelNMDANMDANMDANMDA通道阻滞通道阻滞通道阻滞通道阻滞剂剂三期三期三期三期无效无效无效无效镁镁NMDANMDANMDANMDA受体拮抗受体拮抗受体拮抗受体拮抗剂剂三期三期三期三期无效无效无效无效GV 150526GV 150526GV 150526GV 150526NMDANMDANMDANMDA拮抗拮抗拮抗拮抗剂剂三期三期三期三期无效无效无效无效电压门钙电压门钙通道拮抗通道拮抗通道拮抗通道拮抗剂剂尼莫地平尼莫地平尼莫地平尼莫地平减少减少减少减少钙钙离子内流离子内流离子内流离子内流三期三期三期三期无效无效无效无效钾通道激动剂钾通道激动剂钾通道激动剂钾通道激动剂BMS-204352BMS-204352BMS-204352BMS-204352减少钙离子内流减少钙离子内流减少钙离子内流减少钙离子内流三期三期三期三期无效无效无效无效钠通道拮抗剂钠通道拮抗剂钠通道拮抗剂钠通道拮抗剂磷酸苯妥英磷酸苯妥英磷酸苯妥英磷酸苯妥英降低兴奋性氨基酸释放降低兴奋性氨基酸释放降低兴奋性氨基酸释放降低兴奋性氨基酸释放三期三期三期三期无效无效无效无效5 5 5 5羟色胺能受体激动剂羟色胺能受体激动剂羟色胺能受体激动剂羟色胺能受体激动剂RepinotanRepinotanRepinotanRepinotan三期三期三期三期无效无效无效无效伽马氨基丁酸激动剂伽马氨基丁酸激动剂伽马氨基丁酸激动剂伽马氨基丁酸激动剂氯美噻唑氯美噻唑氯美噻唑氯美噻唑降低兴奋性氨基酸释放降低兴奋性氨基酸释放降低兴奋性氨基酸释放降低兴奋性氨基酸释放三期三期三期三期无效无效无效无效自由基清除剂自由基清除剂自由基清除剂自由基清除剂替拉扎特替拉扎特替拉扎特替拉扎特降低自由基团的损伤降低自由基团的损伤降低自由基团的损伤降低自由基团的损伤三期三期三期三期无效无效无效无效依布硒啉依布硒啉依布硒啉依布硒啉三期三期三期三期无效无效无效无效依达拉奉依达拉奉依达拉奉依达拉奉三期三期三期三期有效有效有效有效NXY-059NXY-059NXY-059NXY-059三期三期三期三期无效无效无效无效星形胶质细胞抑制剂星形胶质细胞抑制剂星形胶质细胞抑制剂星形胶质细胞抑制剂ONO-2506ONO-2506ONO-2506ONO-2506三期三期三期三期无效无效无效无效一氧化氮供体一氧化氮供体一氧化氮供体一氧化氮供体硝酸甘油硝酸甘油硝酸甘油硝酸甘油二期二期二期二期无效无效无效无效一氧化氮阻滞剂一氧化氮阻滞剂一氧化氮阻滞剂一氧化氮阻滞剂芦贝鲁唑芦贝鲁唑芦贝鲁唑芦贝鲁唑减少减少减少减少NONONONO介导损伤介导损伤介导损伤介导损伤三期三期三期三期无效无效无效无效目前临床上还缺少疗效满意的西药目前临床上还缺少疗效满意的西药, 通常采用中西医结合的方法通常采用中西医结合的方法  三、步三、步长脑长脑心通胶囊、丹心通胶囊、丹红红注射液等注射液等活血化瘀、或益气活血中活血化瘀、或益气活血中药药已广泛用于心已广泛用于心脑脑血管疾病，如缺血性心血管疾病，如缺血性心脏脏病、缺血性中病、缺血性中风风等）及血栓性疾病等，具有等）及血栓性疾病等，具有较较好好疗疗效。

效• 第二部分第二部分 脑心同治理论脑心同治理论 一、脑心同治理论继承和发展了中医的整体观、一、脑心同治理论继承和发展了中医的整体观、一、脑心同治理论继承和发展了中医的整体观、一、脑心同治理论继承和发展了中医的整体观、辨证施治理论辨证施治理论辨证施治理论辨证施治理论•“天人合一”的整体观•“因时因地因人”辨证施治•激发人体自身抗御疾病的特点 中医药优势中医药优势二、脑心同治理论的依据中风（脑卒中）胸痹（冠心病）气虚血瘀证证属益气活血 化瘀通络治则证同治则同异病同治赵步长教授认为脑心同治理论对中风、胸痹的认识脑心同治理论对中风、胸痹的认识脑心同治理论的机制研究脑心同治理论的机制研究气虚、血瘀、痰浊、络阻            病机益气、活血、化痰、通络             治则探讨气、血、痰（及瘀）、络的相互关系现代医学实验证据《脑心同治》理论核心： 从整体观角度来诠释心脑血管病（中风、胸痹）的证属与病机、治则（一）中医角度（二）中医脑心同治理论与现代医学认识的相关性中风（脑卒中）胸痹（冠心病）气虚血瘀证证属益气活血益气活血 化瘀通络化瘀通络治则证同治则同异病同治赵步长教授认为宏观准确性宏观准确性微观精确性微观精确性脑心同治理论对中风胸痹认识脑心同治理论对中风胸痹认识：：现代医学对心、脑血管病认识现代医学对心、脑血管病认识：：内皮损伤血小板凝集、活化、血栓形成血浆成分通透性增强单核细胞、淋巴细胞被激活VEGF，淋巴循环泡沫细胞平滑肌细胞移行、增生脂蛋白变性纤维肌性内膜增厚胶原蛋白弹性应蛋白防御结构的障碍（HDL）异常粥样硬化灶粥样硬化灶动脉狭窄、阻塞或痉挛动脉狭窄、阻塞或痉挛临床发作冠心病、脑梗塞等临床发作冠心病、脑梗塞等PDGF 高脂血症、高血压、吸烟高脂血症、高血压、吸烟等等动脉粥样瘢块形成及其后果瘢块开始形成稳定瘢块不稳定瘢块瘢块破裂危险因素危险因素: 高血压、血脂异常高血压、血脂异常 糖尿病、吸烟、糖尿病、吸烟、 肥胖（中心型）肥胖（中心型）动脉粥样硬化动脉粥样硬化左室肥厚左室肥厚冠脉病变冠脉病变心肌缺血心肌缺血冠脉栓塞冠脉栓塞心肌、脑梗死心肌、脑梗死心脑血管病事件链(continuum)神经体液激活神经体液激活心律失常心律失常心肌损失心肌损失心性猝死心性猝死心脏重构心脏重构心室扩大心室扩大心衰心衰心脏病终末期心脏病终末期无症状无症状自然消退自然消退或增大或增大复原复原功能不良功能不良短期死亡短期死亡（（≤28天）天）晚期复发晚期复发（（﹥ ﹥28天）天）晚期死亡晚期死亡（（﹥ ﹥28天）天）疾病疾病状态状态血管内粥血管内粥样瘢块不样瘢块不断发展断发展瘢块或血瘢块或血栓的表面栓的表面破裂破裂症状性缺血症状性缺血 猝死猝死动脉硬化性心脑血管病自然进程 基础病变 促发因素 急性事件 中期和晚期发展 （几年至几十年） （几秒钟或几小时） （几秒钟或几小时） （几天至几年） 时间时间顺序顺序三、中医药防治心脑血管病常用药•益益 气气 药：药：黄芪、太子参等•活血化瘀药：活血化瘀药：水蛭、蜈蚣、地龙、全蝎 当归、川芎、丹参、红花、                              赤芍、桃仁、鸡血藤、牛膝等•理气、通阳药：理气、通阳药：乳香、 没药、桂枝n配伍用药    是中药复方（或方剂）发挥药效的关键，是中医处 方用药的核心n方剂配伍基本内容：“七情合和”与“君臣佐使”理论“君臣佐使君臣佐使”则表明中药配伍中药组分有主有次。

主药在治病中发挥主导作用，辅药在治疗中促使主药药力得以充分发挥，同时抑制主药的毒副作用 中医重视复方用药及其中药配伍理论  丹红注射液、脑心通胶囊等中药制剂相对于西药抗血小板作用机制单一，具有多组分、多靶点作用特点 意味着本品可能有更少耐药性和更少副作用 中药具有多组分、多靶点的作用特征四、中药目前面临的困惑四、中药目前面临的困惑“？？”中药在医学科学领域的作用逐渐被国内外同行认可和关注中药在医学科学领域的作用逐渐被国内外同行认可和关注困惑：困惑：•中药如何发挥作用？中药如何发挥作用？•这些作用如何科学表达？这些作用如何科学表达？•中医药如何合理使用？中医药如何合理使用？•如何达到中药清楚定位并做到如何达到中药清楚定位并做到““精准用药精准用药””？？•目前这些问题尚不十分清楚目前这些问题尚不十分清楚•国内外同行基本一致认同是：国内外同行基本一致认同是：•中药作用物质基础说不清中药作用物质基础说不清•中药作用机理说不清中药作用机理说不清•中药（组分）相互作用说不清中药（组分）相互作用说不清•质量控制、安全问题说不清质量控制、安全问题说不清•中医药应该在临床有效的基础上，更须多关注这些尚未能解决的中医药临床应用的疑难问题，以便更好地为中医临床应用服务。

•换言之:   中医药在这些方面的问题得到解决，将会有力推动中医药学科的快速发展，也会得到国际国内同行和社会对中医药更为广泛认同的效果 开展了丹红注射液、脑心通胶囊发挥治疗冠心病、缺血性中风等血瘀病证的系统研究•如：丹红注射液如何发挥组分相互作用，组分体内过程如何，哪些是具有生物活性的代谢产物，最终通过哪些环节、途径发挥活血化瘀效应最终实现整合调节治疗冠心病、缺血性中风等问题第三部分第三部分第三部分第三部分 丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究1丹红注射液的主要适用病证丹红注射液的主要适用病证 2 丹红注射液中化学成分及代谢产物研究丹红注射液中化学成分及代谢产物研究4丹红注射液对脑缺血性损伤的保护作用丹红注射液对脑缺血性损伤的保护作用5 丹红注射液抗脑缺血性损伤的机制研究丹红注射液抗脑缺血性损伤的机制研究6科研项目、论文、专利情况科研项目、论文、专利情况3 丹红配伍的理论依据丹红配伍的理论依据一、丹红注射液的主要主要适用病证 丹红注射液丹红注射液（国药准字（国药准字Z20026866），），是临床上常用的、有效的中药制剂。

是销售额最高的中药制剂之一，近年，年销售超过10亿元具有活血化瘀、通脉舒络功效用于用于瘀血瘀血闭阻所致的胸痹及闭阻所致的胸痹及中风中风，，证见：证见：胸痛胸痛，，胸闷胸闷，，心悸心悸，口眼歪，口眼歪斜，言语蹇涩，斜，言语蹇涩，肢体麻木肢体麻木，活动不，活动不利等症治疗治疗冠心病冠心病、、心绞痛心绞痛、心肌梗塞，、心肌梗塞，缺血性脑病、缺血性脑病、脑血栓脑血栓及肺心病所瘀及肺心病所瘀诸症运动是一箭多雕的成本效价比最高的预防心血管病的措施高血压高血脂糖尿病肥胖丹红注射液丹红注射液一箭多雕一箭多雕预防心脑血管病机理？预防心脑血管病机理？脑梗死冠心病丹红注射液（国药准字丹红注射液（国药准字Z20026866），为临床上常用），为临床上常用的、有效的中药制剂是销售的、有效的中药制剂是销售额最高的中药制剂之一额最高的中药制剂之一丹红注射液处方用量配比丹红注射液处方用量配比 : 丹参丹参750g，红花，红花250g二、丹红配伍的理论依据二、丹红配伍的理论依据 丹参：丹参： 味苦，性微寒味苦，性微寒，归心、肝经，功效活血化瘀、凉血消肿、宁心安神 红花：红花： 味辛，性温，味辛，性温，归心、肝经，辛散温通，入血分，能活血祛瘀化滞、通调经脉。

二药共奏活血化瘀、通经活络活血化瘀、通经活络之功（一）（一）HPLC-DADHPLC-DAD测定丹红注射液中的有效成分测定丹红注射液中的有效成分6种有效成分紫外检测波长的选择   250300350400450500550600650A波长/nm 6种对照品混合溶液的浓度250300350400450500550600650B波长/nm250300350400450500550600650C波长/nm吸光度（A)250300350400450500550600650D波长/nm250300350400450500550600650E波长/nm吸光度（A)250300350400450500550600650F波长/nmA.丹参素钠；B.原儿茶醛；C.咖啡酸；D.迷迭香酸；E.丹酚酸B；F.丹酚酸A 名称丹参素钠 原儿茶醛 咖啡酸 迷迭香酸 丹酚酸 丹酚酸 浓度（mg·mL-1） 1.310 0.101 0.0041 0.109 0.219 3.360 结果表明： 丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A 检测波长为280 nm； 咖啡酸、迷迭香酸检测波长为330 nm。

三、丹红注射液中化学成分及代谢产物研究三、丹红注射液中化学成分及代谢产物研究混合对照品溶液混合对照品溶液HPLC色谱图色谱图 05101520253035401256t/minA051015202530354034Bt/min0510152025303540156t/minC051015202530354003t/minD 1.丹参素；2.原儿茶醛；3.咖啡酸；4.迷迭香酸；5.丹酚酸B；6.丹酚酸AA.对照品溶液(280 nm)；B.对照品溶液(330 nm)；C.供试品溶液(NO. 110934 280 nm)；D.供试品溶液(NO. 110934 330nm)   色谱条件：色谱柱：Eclipse XDB-C18 (4.6×150 mm，5μm) ；流动相：A为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液；柱温为30℃；流速为1.0 mL•min-1. 时间 0~6 min6~16 min16~30 min30~40 min浓度5%A~5%A5%A~15%A15%A ~26%A26%A~27%A 流动相梯度洗脱程序结果表明：该色谱条件下，样品液中6种成分与其他共存峰得到很好的分离。

 10批丹红注射液中6种成分及总黄酮含量(n=3)批号丹参素μg•mL-1原儿茶醛μg•mL-1咖啡酸μg•mL-1迷迭香酸μg•mL-1丹酚酸Bμg•mL-1丹酚酸Aμg•mL-1总黄酮μg•mL-1111050110934110928110937111042111033110858110926110927110950平均1 464.98 1 238.03 1 391.21 1 363.29 1 378.93 1 308.49 1 346.36 1 570.80 1 390.56 1 309.611 376.23300.54 369.17 445.82 345.23 235.84 268.05 260.56 412.30 364.07 367.06 336.865.40 4.68 7.98 5.39 4.97 5.52 5.05 5.43 6.13 5.495.60262.17 215.75 236.16 286.24 237.06 246.85 163.51 300.25 233.68 259.71 244.13573.65 270.41 297.53 396.47 517.43 441.90 305.84 399.65 310.21 402.57391.574 650.41 4 220.46 4 067.06 5 634.77 5 083.91 4 458.79 3 845.14 5 083.64 4 711.88 4 851.214660.7210 19710 470 9 27711 628 9 686 9 839 9 58311 79910 41811 66310456丹红注射液丹红注射液样品样品中有效成分含量的中有效成分含量的HPLC-DAD测定测定 丹红注射液中6种成分的含量结果表明：色谱条件下，样品液6种成分中丹酚酸A含量最高，咖啡酸含量最低，含量高低依次是丹酚酸A、丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸、咖啡酸。

（二）（二）对对7 7批丹批丹红红注射液注射液进进行指行指纹图谱检测纹图谱检测 1. 标定了28个共有峰，7批丹红注射液指纹图谱相似度均大于0.980，表明工艺较稳定、质量可控 7批丹红注射液指纹图谱与对照指纹图谱2. 72. 7批血批血浆浆、、脑脑、肝、肝脏组织样脏组织样品特征品特征图谱图谱相似度均在相似度均在0.920.92以上，以上，说说明特征指明特征指纹图谱纹图谱相相对稳对稳定、准确，可用于体内成分定性分析定、准确，可用于体内成分定性分析 7批丹红注射液15min血液中指纹图谱 对照指纹图谱 7批丹红注射液60 min脑中指纹图谱 对照指纹图谱7批丹红注射液60 min肝中指纹图谱 对照指纹图谱3. LC-MS（（QTrap 4500））质谱分析丹红注射液成分及其体内代谢物4.EMS-IDA-EPI4.EMS-IDA-EPI扫描模式：所有色谱峰可扫描到扫描模式：所有色谱峰可扫描到EPIEPI谱图，谱图， EMS EMS展示展示107107个扫描到最高峰化合物个扫描到最高峰化合物丹红注射液主要有效成分列表丹参素提取离子流图(XIC, m/z 197)及MS2 通过丹参素特征碎片离子m/z179扫描可以找到结构类似物原儿茶醛提取离子流图(XIC , m/z 137)及MS2 羟基红花黄色素A提取离子流图(XIC , m/z 611→491)及MS2 丹酚酸B提取离子流图(XIC , m/z 717)及MS2 MS3扫描：丹酚酸A：RT10.4min，判断二级碎片来源，比如二级碎片m/z159及m/z185来源小结：丹红注射液中有效成分主要是水溶性的酚酸类组分，极性较大。

5. 丹红注射液代谢产物分析丹红注射液代谢产物分析 丹红注射液中水溶性酚酸类有效成分较多，极性较大；体内I相代谢反应，通过氧化、 还原、水解等途径引入极性，使原药极性增大，利于排泄 主要以丹参素，迷迭香酸，原儿茶醛，原儿茶酸为目标组分，寻找相应代谢物.，丹红注射液代谢产物列表丹参素(Danshensu, DSS)代谢物提取离子流图及二级质谱原儿茶酸原儿茶酸(Protocatechuic acid, DBA)代谢物提取离子流图及二级质谱代谢物提取离子流图及二级质谱原儿茶醛(Protocaterchuic aldehyde, PA)代谢物提取离子流图及二级质谱迷迭香酸(Rosmarinic acid, RA)代谢物提取离子流图及二级质谱特征II相代谢物含量随给药时间变化的趋势(Area：MRM)小结：EMS-IDA-EPI， MRM-IDA-EPI, Pre/NL-IDA-EPI等多种扫描模式结合，发现注射液中含量较高的有效成分丹参素，原儿茶酸，原儿茶醛，迷迭香酸的II相代谢物，主要是甲基化，硫酸化，甲基化后硫酸化，葡萄糖醛酸化等一系列代谢物各时间点代谢样品中丹参素与迷迭香酸原形在代谢样品未检测到，仅检测到代谢物。

初步鉴定丹红注射液中有效成分32个，同时鉴定了主要有效成分的代谢产物CombinationsParametersCom1Com2Com3Com4Com5Com6Com7Com8Com9Emax(U/ml)0.7310.6430.4750.4780.7550.70.6920.7420.701EC50(μg/ml)0.1551.4230.310.120.270.60.240.880.4526. 羟基红花黄色素A与MDA相关的药效动力学参数9个组方时间-羟A药物浓度-MDA三维动态模型（（1 1）丹红注射液对神经功能缺损症状的影响）丹红注射液对神经功能缺损症状的影响   四、丹红注射液对脑缺血性损伤的保护作用四、丹红注射液对脑缺血性损伤的保护作用 Day0 Day3 Day7 Day10 Day14  Neurological assessment Neurological assessment Neurological assessment Neurological assessment MCAO 大脑中动脉栓塞模型（MCAO）示意图 在MCAO模型再灌之后的1d、3d、7d、10d和14d进行神经功能评分: 1.自主活动(0-3) 2. 四肢运动的对称性(0-3) 3. 前肢外伸(0-3) 4. 爬动(1-3) 5.身体触觉(1-3) 6.震动觉(1-3) 其中3分最差，18分正常 Garcia et al. Stroke, 1995. 26(4): 627-634  Day1 Day3 Day7 Day10 Day14  Neurological assessment Neurological assessment Neurological assessment Neurological assessment Neurological assessment 注：*P< 0.01 vs Sham，ΔP< 0.05 vs IRU，#P < 0.01 vs DHI-1 各组在大鼠脑缺血后不同时间点的神经功能缺损评分变化曲线11（（2 2）丹红注射液对大鼠脑缺血后脑梗死体积的影响）丹红注射液对大鼠脑缺血后脑梗死体积的影响 A 假手术组 B 模型组 C 丹红注射液 0.5 ml/kg D 丹红注射液 1.0 ml/kg E丹红注射液 2.0 ml/kg MCAO法制作大脑中动脉局灶性栓死模型    丹红注射液对大鼠脑缺血后脑梗死体积的影响组别剂量（ml/kg）n总梗死体积（mm3）假手术组NS10 0  0模型组NS10 213.5  72.4*丹红低剂量组0.510152.7 53.8#丹红中剂量组1.010 116.5 47.6##▲丹红高剂量组2.010 103.2 54.2##▲注：* P<0.05，** P<0.01, 与对照组比较，F检验；# P<0.05,##P<0.01，与模型组比较，F检验。

▲P<0.05，与低剂量组比较，F检验 丹红注射液对大鼠脑缺血后脑梗死的影响结果可见：结果可见：丹红注射液可使梗死总体积减少丹红注射液可使梗死总体积减少, ,与模型组相比具有显著性差异与模型组相比具有显著性差异 五、丹红注射液抗脑缺血性损伤的机制研究五、丹红注射液抗脑缺血性损伤的机制研究自由基过度形成自由基过度形成炎症反应炎症反应纤溶系统受损纤溶系统受损兴奋性氨基酸毒性兴奋性氨基酸毒性细胞凋亡细胞凋亡神经系统损伤神经系统损伤（（1 1）丹红注射液对脑缺血再灌注大鼠脑皮质）丹红注射液对脑缺血再灌注大鼠脑皮质SODSOD活力和活力和MDAMDA含量影响含量影响 丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质SOD活力和MDA含量的影响(X±SD)组别剂量（ml/kg）nSOD（NU/ mg）MDA（nmol/mg.）假手术组NS10 541.8±48.5 411.6±36.5模型组NS10272.4±35.1*947.2±86.4*丹红低剂量组0.510312.2±42.21858.3±93.9丹红中剂量组1.010364.5±45.89#782.3±95.4丹红高剂量组2.010397.1±50.61# 689.3±95.4 #▲注：* P<0.05，** P<0.01, 与对照组比较，F检验；# P<0.05，##P<0.01，与模型组比较，F检验；▲P<0.05，与低剂量组组比较，F检验。

 丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质SOD活力的影响丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质MDA含量的影响结结果表明：果表明：（（1 1））脑脑缺血再灌注缺血再灌注组组与假手与假手术组术组相比，相比，SODSOD活力、活力、MDAMDA含量均具有含量均具有显显著差异2 2）丹）丹红红注射液可注射液可显显著提高著提高脑脑缺血再灌注缺血再灌注损伤损伤大鼠大鼠脑脑皮皮质质SODSOD活力，高活力，高剂剂量量组显组显著降著降低低脑脑缺血再灌注大鼠缺血再灌注大鼠脑脑皮皮质质MDAMDA含量 （（2 2）丹红注射液对脑缺血再灌注大鼠脑皮质）丹红注射液对脑缺血再灌注大鼠脑皮质6-Keto-PGF6-Keto-PGFlαlα含量的影响含量的影响 丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑6-Keto-PGFlα含量的影响(X±SD)组别剂量（ml/kg）n6-Keto-PGFlα假手术组NS10 86.31±8.31模型组NS1034.07±5.23*丹红低剂量组0.51051.11±6.81 #丹红中剂量组1.01059.23±7.83##丹红高剂量组2.010 65.36±7.52## ▲注：* P<0.05，** P<0.01, 与对照组比较，F检验；# P<0.05，##P<0.01，与模型组比较，F检验；▲P<0.05，与低剂量组组比较，F检验。

结果表明：结果表明：（（1 1）脑缺血再灌注组与假手术）脑缺血再灌注组与假手术组相比具有显著差异；组相比具有显著差异；（（2 2）丹红注射液各组能显著提）丹红注射液各组能显著提高脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质高脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质6-Keto-PGF6-Keto-PGF1α1α的含量；的含量；（（3 3）丹红注射液中、高剂量与）丹红注射液中、高剂量与低剂量相比具有显著差异低剂量相比具有显著差异 丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑6-Keto-PGFlα含量的影响（（3 3）丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠血浆）丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠血浆t-PAt-PA活性和活性和PAIPAI活性的影响活性的影响 丹红注射液对脑缺血再灌注大鼠血浆t-PA活性和PAI活性的影响 (X±SD)组别剂量（ml/kg）nt-PA（IU/ ml）PAI（IU/ml）PAI / t-PA假手术组NS10 0.912±0.073 0.652±0.049 0.715模型组NS100.511±0.079*0.921±0.065*1.802丹红低剂量组0.5100.632±0.072#0.891±0.0751.410丹红中剂量组1.0100.689±0.082#0.842±0.0711.222丹红高剂量组2.0100.697±0.083#0.762±0.068#1.093注：* P<0.05，** P<0.01, 与对照组比较，F检验；# P<0.05，与模型组比较，F检验。

t-PA：组织型纤溶酶原激活物；PAI：纤溶酶原激活物抑制因子结结果表明：果表明：（（1 1））脑脑缺血再灌注缺血再灌注组组与假手与假手术组术组相比均相比均具有具有显显著差异；著差异；（（2 2）丹）丹红红注射液各注射液各组组与与脑脑缺血再灌注缺血再灌注组组相比，可相比，可显显著提高著提高t-PAt-PA活性，降低活性，降低PAIPAI活活性，具有增性，具有增强强机体的机体的纤纤溶功能、促溶功能、促进进血栓血栓溶解的作用溶解的作用（（4 4）丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注后）丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注后 Bcl-2 Bcl-2、、BaxBax蛋白表达的作用蛋白表达的作用 各组缺血侧大脑皮层Bcl-2 、Bax免疫组化阳性细胞数组别剂量（ml/kg）nBcl-2阳性细胞数Bax阳性细胞数Bcl-2/Bax假手术组NS10 55.9 12.7 32.39.7 1.73模型组NS1084.4 15.6*86.815.2**0.97丹红注射液1.010126.1 18.2 #47.312.9#2.66注：* P<0.05，** P<0.01与假手术组比较；# P<0.05，##P<0.01，与模型组比较，F检验。

A Bcl-2假手术组，B Bcl-2 模型组，C Bcl-2丹红注射液组， D Bax组， E Bax-假手术组，F Bax-丹红注射液组 结果表明：（1）假手术与模型组相比，模型组缺血侧大脑皮层Bcl-2免疫组化阳性反映细胞数显著增多2）丹红注射液组与脑缺血再灌注模型组相比Bcl-2阳性细胞数显著增多3）丹红注射液与模型组相比，可使Bax蛋白的表达降低4）丹红注射液具有显著调节Bcl-2/Bax蛋白的表达，抑制神经元凋亡，保护脑组织的作用 图图 2 微透析套管埋植微透析套管埋植 123123混合对照品溶液和透析液的HPLC图注：1.天门冬氨酸；2.谷氨酸；3.γ-氨基丁酸； A.人工脑脊液溶液 B.对照品溶液；C.空白大鼠头部透析液图图 1大脑中动脉阻塞模型（大脑中动脉阻塞模型（MCAO））0100200300400500600700800900-50050100150200模型组丹红组  丹红注射液对脑缺血大鼠脑海马区Asp释放的影响050100150200250300350400-50050100150200模型组 丹红注射液对脑缺血大鼠脑海马区Glu释放的影响min丹红组02000400060008000100001200014000-50050100150200模型组丹红组丹红注射液对脑缺血大鼠脑海马区GABA释放的影响（（5 5）丹红注射液对脑部微透析液氨基酸递质释放的影响）丹红注射液对脑部微透析液氨基酸递质释放的影响丹红注射液通过调节脑内氨基酸递质的含丹红注射液通过调节脑内氨基酸递质的含量，对脑缺血起到一定的保护作用。

量，对脑缺血起到一定的保护作用丹红注射液抑制炎症因子丹红注射液抑制炎症因子TNF-α、、IL-1β的表达的表达，丹红注射液，丹红注射液对炎症的抑制在脑缺血后恢复的过程中起着重要的作用对炎症的抑制在脑缺血后恢复的过程中起着重要的作用  开展的部分相关研究内容开展的部分相关研究内容（（6 6））丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织脑组织TNF-TNF-αα和和IL-1βIL-1β炎症因子的炎症因子的影响影响丹红注射液对大鼠脑缺血后脑组织中TNF-α和IL-1β含量的影响（（7 7）丹红注射液对大鼠大）丹红注射液对大鼠大脑缺血脑缺血后葡萄糖代谢的影响后葡萄糖代谢的影响        分子影像技术能够无创监测生物分子影像技术能够无创监测生物体内细胞和分子水平的生化过程，尤体内细胞和分子水平的生化过程，尤其是其是18F-FDG-PET（（正电子发射断层正电子发射断层扫描扫描技术技术）能够定量地无创监测葡萄）能够定量地无创监测葡萄糖代谢的变化，被广泛应用于脑血管糖代谢的变化，被广泛应用于脑血管病疗效的评价病疗效的评价 MACO Day0 Day3 Day7 Day10 Day14 PET ScanPET ScanPET Scan      利用利用18F-FDG-PET 来研究丹红注射液对大鼠脑缺血再灌来研究丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注注损伤的作用损伤的作用，丹红，丹红注射液组的注射液组的R/N变化值在给药后变化值在给药后7d、、14d较模型组显著增加，较好地促进了梗死较模型组显著增加，较好地促进了梗死区葡萄糖代谢的恢复区葡萄糖代谢的恢复。

大鼠脑部FDG-PET横断切面的图像 R/N变化值 梗死区周边的GFAP（胶质纤维酸性蛋白）免疫组化染色分析图      ( #P < 0.01 vs Sham, **P < 0.01 vs IRU, ΔP < 0.05 vs DHI-1)ShamIRUDHI-2DHI-1DHI-4 GFAP（200x）（（8 8）丹红注射液对大鼠）丹红注射液对大鼠脑缺血后星形胶质细胞活化脑缺血后星形胶质细胞活化的影响的影响        丹红注射液促使脑缺血后星形胶质细胞进一步活化，大量表达丹红注射液促使脑缺血后星形胶质细胞进一步活化，大量表达GFAP，从而，从而促进脑缺血后神经功能的恢复促进脑缺血后神经功能的恢复  丹红注射液能够明显抑制缺氧诱导的脑内丹红注射液能够明显抑制缺氧诱导的脑内皮细胞早期凋亡进程和和皮细胞早期凋亡进程和和G1/SG1/S期阻滞，且呈期阻滞，且呈剂量依赖性剂量依赖性内皮细胞内皮细胞10100 0××兔抗鼠兔抗鼠ⅧⅧ因子抗体鉴定因子抗体鉴定************采用采用原代培养原代培养的的乳鼠脑微血管内皮细胞乳鼠脑微血管内皮细胞，建立缺氧损伤模型建立缺氧损伤模型。

9 9）丹红注射液对）丹红注射液对乳鼠脑微血管内皮细胞乳鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤的缺氧损伤的保护作用保护作用正常组正常组模型组模型组尼莫地平组尼莫地平组100uL/mL组组50uL/mL组组25uL/mL组组 A 正常组 B 模型组C 丹红注射液100uL/mL组丹红注射液对缺氧细胞超显微结构的影响（6K×） 组别 C/(uL.mL−1)        SOD (U/mg)                MDA(nmol/mL)正常组         －      85.55±3.58                4.09±0.50模型组         －      29.35±1.04▲▲                  10.18±1.35▲▲丹红注射液组25      33.97±4.20                8.80±1.00 50      57.26±4.70**             6.75±0.55**              100      70.05±3.38**             5.49±0.51**与正常组比较：▲▲P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 丹红注射液对缺氧损伤的rBMECs SOD活性和MDA水平的影响（x±s，n=6）A 正常组 B 模型组C 丹红注射液100uL/mL组 RT-PCRRT-PCR法检测法检测P53P53、、MMP-9MMP-9、、ICAM-1 mRNAICAM-1 mRNA的表达的表达扩增曲线图溶解曲线图        扩增曲线拐点清楚，整体平行性好，基线平而无上扬现象，曲线指数期斜率与扩增效率成正比，各反应管的扩增曲线平行性好，表明扩增效率良好且相近。

        溶解曲线直接表示了引物的特异性，TM值基本都在80-90度之间，三个引物都出现单一峰，说明特异性扩增良好      下调下调P53 mRNA表达来抑制表达来抑制rBMEC早期早期凋亡和凋亡和G1/S期阻滞；期阻滞； 下调下调ICAM-1 mRNA表达介导黏附反应、表达介导黏附反应、促进内皮细胞迁移、降低内皮细胞活性；促进内皮细胞迁移、降低内皮细胞活性； 下调下调MMP-9 mRNA表达促进血管生成表达促进血管生成以正常组为对照进行相对定量分析，丹红注射液以正常组为对照进行相对定量分析，丹红注射液100、、50uL/mL均能明显均能明显降低降低MMP-9、、ICAM-1、、P53 mRNA的表达水平的表达水平 桥粒连接 绒毛电镜观察 （（Caco-2 21d 200×））光镜观察 药物通过小肠上皮细胞转运途径示意图药物通过小肠上皮细胞转运途径示意图体外体外Caco-2细胞模拟体内吸收，考察丹红注射液的主要有效成分配伍细胞模拟体内吸收，考察丹红注射液的主要有效成分配伍在在口服给药后口服给药后的吸收效果的吸收效果口服给药口服给药吸收吸收 小肠小肠指导指导剂型结构成本能否吸收吸收机制影响因素代谢特点吸收效率转运样品HPLC检测（（1010）丹红注射液）丹红注射液主要有效成分配伍体主要有效成分配伍体外外吸收吸收特性特性R2X(cum)=0.646R2Y(cum)=0.75, Q2=0.58（R2Y和Q2 大于0.5时，说明模型较好）负负离子模式下血清的离子模式下血清的PLS-DA得分图得分图(11(11）丹红注射液调节血脂代谢的作用）丹红注射液调节血脂代谢的作用 以高脂血症大鼠为模型，通过生化、分以高脂血症大鼠为模型，通过生化、分子生物学及代谢组学技术与方法，探讨子生物学及代谢组学技术与方法，探讨丹红注射液在调节血脂代谢方面的作用丹红注射液在调节血脂代谢方面的作用机理，为其治疗脂代谢相关疾病提供科机理，为其治疗脂代谢相关疾病提供科学理论依据。

学理论依据六、六、 科科 研研 项项 目目项￿￿￿￿￿￿￿￿目目￿￿￿￿￿￿￿￿名名￿￿￿￿￿￿￿￿称称来来￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿源源基于中西药相互作用的谷红注射液多组分药物代谢与药效相关性研究国家自然科学基金（No.81373898）基于药物相互作用的丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究国家自然科学基金项目（No.81173647）丹参、川芎（参芎注射液）活性物质配伍方的多成分药物代谢动力学与对脑缺血性损伤保护作用的相关性研究国家自然科学基金项目（No.81274176）丹参红花多组分配伍方（丹红注射液为示范）药物体内过程与抗血栓效应相关性研究国家自然科学基金项目（No.81473587）基于K+/Glu激活钙信号通路的丹红注射液脑靶向活性成分筛选及神经保护机制研究浙江省自然科学基金项目（No.Y13H280035）中药（丹红配伍为例）多成分药动学与药效学相关联的方法学研究浙江省科技厅项目（No.2013C33244）已正式发表已正式发表20余篇，余篇，待发表论文待发表论文15篇篇He Y, Wan H, Du Y. et al. Protective effect of Danhong injection on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Journal of Ethnopharmacology, 2012, 144(2): 387-394.（SCI收录，影响因子3.014）黄翔,何昱,杨洁红,等. HPLC-DAD法与UV-VIS法对丹红注射液有效成分和有效部位的质量控制研究.中华中医药杂志, 2013,04(28）（国家一级）周鹏,周惠芬,何昱,等.丹红注射液对乳鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用.中草药, 2013,44(19):2727-2731. （国家一级）Zefeng Wang, Fahuan Song, Jinhui Li, et al. PET Demonstrates Functional Recovery after Treatment by Danhong Injection in a Rat Model of Cerebral Ischemic-Reperfusion Injury，Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2014 (2014), Article ID 430757, 9 （SCI收录,影响因子4.774）Juan Chen, Jun Deng，Yuyan Zhang, et al. Lipid-lowering effects of Danhong injection on hyperlipidemia rats.Journal of Ethnopharmacology，2014，154 (2)：437-442. （SCI收录，影响因子3.014）汪兴宇,张宇燕,万海同,等.参芎注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用.中国中药杂志，2014，39（3）：503-506. （国家一级）周鹏,周惠芬,何昱,等.羟基红花黄色素A在Caco-2 细胞单层模型的转运研究.中草药，2014，45（14）：2030-2035. （国家一级）舒明春,万海同,周惠芬,等.谷红注射液抗脑缺血性再灌注损伤的作用及其机制.中国中药杂志，2014，39（23）：44-48. （国家一级）艾进超,周惠芬,舒明春,等.丹参素在局灶性脑缺血大鼠体内药动学-药效学相关性研究.中国中药杂志，2014，39（14）（国家一级）戴柳玲,万海同,周惠芬,等.谷红注射液对缺糖缺氧致乳鼠脑微血管内皮细胞损伤的保护作用.中国药学杂志，2014,49(21)（国家一级）管敏国,张宇燕,万海同,等.丹参川芎有效成分配伍对缺氧损伤大鼠脑内皮细胞的影响.安徽中医药大学学报,2014,12(21）（国家二级）周鹏,何昱,杨洁红，等.丹红注射液对缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护机制.中国中药杂志，2014,39(23)：59-63. （国家一级）王玉,温伟为,张宇燕,等.基于析因设计的丹红注射液活性物质配伍抗神经元损伤的交互作用.中国验方剂学杂志,2014,20(17):（国家二级）Effects of Danhong injection and its main components on anticoagulation and fibrinolysis in cultured HUVECs, Chinese Journal of Integrative Medicine,已修回（SCI收录,影响因子1.401）周惠芬,艾进超,舒明春,等.丹红注射液体内外指纹图谱分析研究.中华中医药学刊,已录用（国家一级）周惠芬,周鹏,何昱,等.丹红有效成分配伍对缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用.中国中药杂志,已录用（国家一级）申杰,何昱,杨洁红,等.脑心同治理论与实践探讨.陕西中医学院学报,已录用（国家二级）周惠芬,何昱,张宇燕,等.参芎注射液对缺血再灌注损伤大鼠炎症损伤的影响.中国中药杂志,已修回（国家一级）丹红注射液及有效成分对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用机制研究The protective effect of Danhong injection on the brain dopamine in the rat model of cerebral ischemia/reperfusion injuryEffects of GuHong injection on cerebral TNF-α, IL-1β and MMP-9 in rats experienced focal cerebral ischemia/reperfusionDetermination of three kinds of amino acids neurotransmitters in the tissue of the rats by HPLC electrochemical methodEffects of Shenxiong Injection on cerebral ischemia-reperfusion inflammatory injury of rats基于K+/Glu激活钙信号通路探讨丹红注射液对神经保护机制研究杜成昊,张宇燕,万海同,等.从中西医角度探讨“脑心同治论”理论内涵.浙江省中西医结合学会脑心同治第二次学术年会，2014年6月.申杰,何昱,杨洁红,等.脑心同治理论与实践探讨.浙江省中西医结合学会脑心同治第二次学术年会，2014年6月.韩进,张宇燕.从气虚血瘀之代表方补阳还五汤论证脑心同治.浙江省中西医结合学会脑心同治第二次学术年会，2014年6月.      下一步下一步拟深入开展的步长制剂药物研究拟深入开展的步长制剂药物研究---侧支循环侧支循环研究丹红注射液是否通过激肽原酶-激肽系统（KKS）、Apelin /APJ信号通路等，靶向性开启缺血区侧支循环，改善脑血流灌注。

血小板聚集的三个重要途径或靶点•血小板环氧化酶代谢花生四烯酸途径v血小板活化因子的血小板活化因子的活化途径、活化途径、v血小板膜蛋白血小板膜蛋白GPⅡb/ⅢaGPⅡb/Ⅲa途径途径谢谢！谢谢！。