浙液相色谱讲义五：液相色谱的实用技术,色谱柱的保养、样品前处理.ppt

液相色谱实用技术色谱柱的使用及保养良好的色谱实验习惯`拿到一根新色谱柱时，先测柱效`保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录 条件`定期检测柱效`定期检测仪器的谱带展宽色谱柱的使用及操作`流动相的转换 .特别是GPC柱`流速(压力)的变化幅度`温度的变化幅度`专用色谱柱∶样品及溶剂的要求色谱柱的保养（一）`样品方面 .除去微粒及杂质 .了解样品在流动相中的溶解度à如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶 解度，防止其在流动相中析出 .了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用色谱柱的保养（二）`流动相方面 .除去微粒 .纯度的要求à超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低à缓冲液的pH值，在填料的允许范围内à缓冲液（盐）的浓度à溶剂：色谱纯，并与填料相匹配à溶剂中的杂质含量 .流动相对样品的溶解度à有机溶剂或水的比例的保护装置`给色谱柱提供物理的保护 .除去样品及流动相中的颗粒`给色谱柱提供化学的保护 .防止分析柱被化学污染`装置 .过滤器 .自装填料保护柱 .预装保护柱过滤器`In-Line Filter，部件号 WAT084560.防止颗粒在色谱柱头累积 .优点：基本不影响柱效 .在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸 分析）`可更换的消耗品 .更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs) .更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs)保护柱`可避免化学污染。

多数保护柱影响到整个 色谱柱的柱效，特别是在用微柱时`保护柱的种类 .普通自装填料的保护柱àWaters的部件号，WAT084550，用户自装填料à影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大 .Guard-Pak预装保护柱àWaters的部件号，WAT088141à有各种填料的预装柱供选择，使用方便填料容 积较小，也引起柱效降低可换芯式保护柱新型的保护柱 — Sentry Guard`适应的用户类型 .非常脏, 非常复杂的样品本底à生化样品, 溶液à环境样品à食品 .不想作太多的固相萃取 .不想降低柱效新型的保护柱 — Sentry GuardSentry Guard 的特点`特点 .高质量, 高效填料 - 不损失柱效 .增加分析柱效 - 增加适应范围 .20mm柱长 - 脏样品载荷能力大，能延长保 护柱寿命 .手可拧紧接头，安装时不需要工具à通用柱套 - 适用于所有的HPLC柱(3.9及4.6内径)à整体式（对Waters柱）- 使用方便，容易 .各种不同填料配合Waters柱Sentry Guard 的规格`产品描述 .3.920mm柱长 .适应任何色谱柱，不需工具即可安装及更换 .可换柱芯式设计，提供各种填料:àBondaPak: C18, phenyl, CN, NH2, SilicaàNova-Pak: C18, C8, phenyl, CN, SilicaàResolve: C18, C8, SilicaàDelta-Pak: C18, C4àSymmetry:C18, C8色谱柱的清洗`对所做的样品要有充分的了解à用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗`硅胶柱的一般方法à先用甲醇洗去极性杂质à用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化`键合相柱(烷基)的一般方法à20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗色谱柱的存放`存放前的处理 .除去杂质、盐 ￿￿`合适的存放溶剂`避免色谱柱床的干枯`避免机械震动`防止细菌生长`注意存放的温度色谱柱常见毛病`柱压过高 .多少才算高?à不同色谱柱有差异à不同系统有差异à不同溶剂有差异`柱效低`重复性差`不出峰，回收率低柱压过高` 为什么柱压会过高.微粒堵塞à样品à流动相à密封垫 .柱床膨胀 .不可逆吸附 .细菌生长柱效低`为什么柱效低 .色谱柱被污染 .过滤片部分堵塞à样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 .色谱柱内的死体积à流动相pH值及组成不合适造成固定相流失à流速急剧变化造成固定相物理损坏à机械震动造成固定相产生裂缝à柱床收缩或干枯重复性差、回收率低`实验的重复性差 .色谱柱被污染 .流动相pH值及组成不合适造成键合相流失 .样品溶剂不同或样品本身不稳定`回收率低，不出峰 .“不可逆”吸附 .固定相过强或流动相过弱 .非特异性吸附色谱柱以外的因素（一）`“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！.仪器问题：连接不好造成死体积à进样器à检测器à管路，连接口à保护柱à过滤器堵塞 .流动相问题：色谱柱未平衡好 .进样量太大色谱柱与仪器的联接`除HP外，不同公司产品，其接头不同。

处 理不当时，会造成： .色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏`解决办法： .自制相应的转换接头 .使用“通用”型接头（锥箍及螺母）à这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接 不同的色谱系统及色谱柱从Phase Separations 公司能得到一些PEEK工程塑料的接头，可用在 所有类型的色谱柱上的Waters色谱柱的联接`Waters及Phase Separations锥箍及螺母相同， 但锥箍前露出不锈钢管长度不同，其长度被称为 ：“stop-depth”`Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用 的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130 英寸`Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations公 司其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准，其 stop-depth 为0.090英寸不同的Stop-Depth长度色谱柱以外的因素（二）`柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！ .系统反压问题à阻尼器堵塞à进样器堵塞à管路或连接口堵塞à过滤器不干净à保护柱 .压力传感器不准确 .流速是否错误?色谱柱以外的因素（三）`实验的重复性差 .梯度实验时平衡时间不足 .温度波动 .流动相组成改变 .样品溶剂不同 .样品稳定性不好 .方法的开发不好à缓冲液的pH值不合适à缓冲液的缓冲能力不足简单的判别方法`高的柱反压是否伴随着 .保留时间变化? .峰形变坏? .分辨率变坏? `测量色谱系统的谱带展宽 .典型的分析系统应远小于 100 微升 .如大于此数应检查仪器系统测量色谱系统的谱带展宽`卸下色谱柱，用UNION代替之`按测柱效方法，以1/10的样品浓度进样，大约2~5微升`用5 sigma方法测4.4%峰高处的峰宽：W`仪器参数∶ .流速∶1.0 ml/min .纸速∶20 cm/min (用记录仪时，接检测器10mV档) .检测器灵敏度∶0.5-1.0AUFS (用记录仪时) .检测器时间常数∶小于0.2`谱带展宽（ml） =1000×W（cm）/20（记录仪） =1000×W（min） （工作站）流动相及样品的预处理液相色谱实用技术（二）液相色谱对流动相的要求`除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶.与检测器匹配 .脱气 .避免卤素离子（不锈钢系统） .溶剂的粘度 .细菌的生长￿￿流动相的脱气`流动相脱气的目的 .使色谱泵的输液准确à输液均匀准确，并且脉动减小à保留时间及色谱峰面积的重现性提高 .提高检测的性能à防止气泡引起的尖峰à基线稳定，信噪比增加à溶剂的紫外吸收本底降低 .保护色谱柱à减少死体积à防止填料的氧化流动相脱气的方法`加热 .简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。

但容易造成流动相 组成的变化`抽真空 .同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果`超声波 .简单，但效果不理想`通惰性气体（一般用氦气） .可保持连续脱气，多用于低压梯度`脱气机 .可保持连续脱气，多用于低压梯度样品的预处理`样品预处理的目的 .除去微粒 .减少干扰杂质 .浓缩微量的组份 .提高检测的灵敏度及选择性 .改善分离的效果 .有利于色谱柱及仪器的保护样品的预处理重要性`占样品分析时间的比例 .样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间`占分析的消耗总成本最大 .消耗大量的溶剂及其他化学品`实验的重复性及准确性最差的环节 .影响实验结果好坏的最重要因素 ë 是决定性的步骤样品预处理常用的方法`高速离心`过滤、超滤`选择性沉淀`衍生反应`液-固萃取 / 液-液萃取 . Sep-Pak样品处理小柱`其他样品预处理的过程去除微粒`过滤 .过滤膜/过滤装置à有机(0.5m)/无机(0.45m)à膜片可更换 .一次性使用的膜“Cartridge”à使用方便简单，交叉污染小à有更小内径，可用于微量样品的处理`高速离心à大于：10,000g超滤`机理 .超滤是一种基于分子量分离的技术`目的 .根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分 为不同的馏份 .除去小分子样品中的大分子蛋白 .脱盐选择性沉淀`常用于生化样品中除蛋白 .有机溶剂à乙腈，甲醇 .强酸à三氯乙酸，过氯酸 .盐à50% 硫酸铵à10% TCA样品衍生`提高检测的灵敏度 .增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 .增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器`改变分离的选择性 .改变组份的基团，如：à变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离`典型的例子 .氨基酸分析样品衍生∶氨基酸分析AccQ-Tag 衍生法浓缩样品`浓缩样品的方法 . 萃取/吹干 . 沉淀/再溶解 . 色谱法 . 液固抽提/Sep-Pak小柱固相萃取（SPE）技术`固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的 产品，分离复杂样品中的不同组份`固相萃取技术（SPE）的重要性 .实验室中60~80%的成本及工作量在样品制备上à加速样品的制备时间à降低样品前处理的成本à提高分析的准确性及回收率à更容易自动化à减少样品处理步骤à降低对不稳定样品的影响à提高安全性Waters的Sep-Pak小柱`Waters专门开发了固相萃取技术（SPE）`Sep-Pak小柱的应用领域.除去杂质及干扰组份 .把样品分成不同极性的组分析 .富集微量的组份`Sep-Pak小柱的主要种类.反相 .正相 .离子交换Sep-Pak的种类`根据Sep-Pak及样品的性质，选洗脱强度不同的 溶剂把样品分开`让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不 与固定相作用 . 让所感兴趣的样品通过小柱，杂质留在柱上 . 让杂质留在柱上，所感兴趣的样品通过小柱各种Sep-Pek小柱（一）`正相 .包括∶Silica / Florisil / NH2 / Diol / CN / Aluminaà可先用6到10倍柱体积的非极性（通常是样品溶液）平衡à加入样品à用非极性溶剂洗脱不想要的组份à用极性溶剂洗脱第一组感兴趣的组份à用极性更强的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份 .在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交换 ，如∶NH2 / CN .确认回收率各种Sep-Pek小柱（二）`反相 .包括∶C18 / tC18 / C8 / tC2 / Diol / NH2 / CNà可先用6到10倍柱体积的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍à柱体积的水或缓冲液平衡，不要让小柱干了à样品溶解在强一些极性的溶剂中à加入样品à用强极性溶剂洗脱不想要的组份à用极性弱些的溶剂洗脱第一组感兴趣的组份à用极性更弱的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份 .确认回收率各种Sep-Pek小柱(三)`离子交换 .包括∶Accell Plus CM / Accell Plus QMA / NH2à可先用6到10倍柱体积的去离子水或弱缓冲液平衡，à样品溶解在去离子水或弱缓冲液中à加入样品à用弱缓冲液洗脱不想要的组份à用强一些缓冲液（改变pH或离子强度）洗脱第一组感兴趣 的组份à用更强的缓冲液洗脱剩下的感兴趣的组份 .确认回收率Sep-Pak小柱的方法开发`SPE方法开发的几个关键因素.文献查阅àWaters有专门Sep-Pak应用资料的数据库（P/N = 88286）à查阅Waters的网页（） .流速控制à同色谱理论：以10ml/min润湿小柱，1~5ml/min加载样品à离子交换填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速 加载样品à以1~5ml/min流速洗脱样品 .注意样品本底。