植物五种酶活性检测方法计划.doc

欢迎阅读选择茶树不同样品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同样的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX五种酶活1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定适合茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为7.2的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（0.1mol/L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min离心35min，取上清液，过滤获取初酶液取200ml初酶液，加入0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.6)200uL,混杂反应液1.2ml（ 0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：0.1脯氨酸：1%邻苯二酚=10:2:3），反应30min（37℃恒温水浴锅），6mol尿素1.2ml停止反应，460nm波长测吸光度比较为不加邻苯二酚的反应混杂液酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分钟增加0.01为一个活性单位2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定称取新鲜样品0.5g于预冷研钵中，加入6ml0.1mol/L（pH8.8）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适合的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。

混匀后在4℃冰箱中浸提4h4℃10000r/min离心20min，取上清液即为酶提取液取酶提取液0.2ml，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/LL-苯丙氨酸，2.8ml蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min，冰浴中停止反应，测定OD290值，以同样体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为比较PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度变化0.01OD为一个活力单位3、脂氧合酶(linoleate:oxygenoxidoreductase，LOX)活性的测定欢迎阅读取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP[聚乙烯吡咯烷酮）（先加3ml研磨，再加2ml冲洗研钵），研磨匀浆，转入离心管后于冰箱中冷提12h1000r/min离心20min,获取酶初提液。

取 200mlPBS[磷酸缓冲液]（0.2M，pH6.0），加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml30%的H202,混匀后保存于冰箱中备用取3ml反应液并加入30ul酶液，以PBS为比较调零，此后测定OD470值（测定30s读数一次，5分钟）边加样边测定，若是慢的话，要保证每个样品从加好样到开始计时的时间相差不大）酶活性计算：以每分钟OD值得变化（高升）0.01为一个酶活性单位（u）POD=（A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/g?min)?A470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液整体积（ml，(1.6ml）；Vs为测准时取用酶液体积（ml，30ul）5、过氧化氢酶（CatalaseCAT）活性测定取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP）（先加3ml研磨，再加2ml冲洗研钵），研磨匀浆，转入离心管后于冰箱中冷提12h1000r/min离心20min,获取酶初提液取 200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。

取 3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为比较调零，测定OD240（紫外）测定30s读数一次，5分钟）酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）CAT=[A240×Vt]/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)欢迎阅读A240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液整体积（ml，1.6ml）；Vs为测准时取用酶液体积（ml,0.1ml）。