微藻培养方法汇总.docx

微藻的培养方式，有多种类型，现介绍一些主要的培养方式一） 纯培养与单种培养纯培养与单种培养是按培养的纯度来划分的纯培养：是指排除了细菌在内的一切生物的条件下进行的培养纯培养要求有 无菌室、超净工作台等设备条件，容器、工具、培养液等必须严格灭菌纯培 养是科研工作中不可缺少的技术 单种培养：生产性的培养中，是不排除细菌存在的，为了区别于纯培养而称之 为单种培养二）一次培养、连续培养和半连续培养该类培养是按采收方式划分的一次培养：又称有限培养，是在一定的容器中，根据藻类需要加入无机和有机 营养，配成培养液，把少量的藻种接种进去，然后在适宜于藻类生长的环境条 件（温度、盐度、光照、PH 值等）下培养，待藻液达到一定的密度后，便一 次性采收或作进一步扩大培养连续培养：一般在室内进行，采用自动控温、人工光源、封闭式通气培养在 培养容器内，新的培养液不断流入，达到一定密度的培养液不断流出培养液 的流入量和流出量可根据微藻的生长情况及需要进行人不控制，并保持平衡 在培养过程中，营养物质浓度和藻类细胞相对稳定，产量高，在国外应用较多， 我国目前生产上很少采用半连续培养：是指在一次培养的基础上，当藻类细胞达到一定密度后，每天收 获一部分浓藻液，并加入新的营养液继续培养。

半连续培养是生产中常用的方 法，每天的收获量根据育苗的需要及藻液的生长情况确定三）藻种培养、中继培养和生产性培养该类培养是按培养的规模和目的来划分的藻种培养：在室内进行，一般采用一次性培养法培养容器为 100-3000 毫升 的三角烧瓶，瓶口用消毒的纸或纱布包扎目的是培养和供应藻种中继培养：目的在于培养较大量的高密度纯种藻液，供应生产性培养接种使用 中继培养一般在室内用大的玻璃容器或塑料大袋中进行根据需要可分为一级 中继培养和二级中继培养一级中继培养的容器为 10 升的大口玻璃缸（南方 各省多用）、10-20 升的细口瓶或鱼苗袋，以封闭式不通气培养为主二级中 继培养的容器为 0.2-0.4 立方米的水族箱、0.5-1.0 立方米的玻璃钢水槽、0.5- 1.0 立方米的小型水泥池等，以开放式通气一次性培养为主；利用塑料大袋进 行二级中继培养也是新兴的、有效的好方法（见图 2-13） 生产性培养：可在室内也可在室外，有封闭式培养和开放式培养两种类型目 的是供给育苗中的饵料培养容器为大型水泥池、大型玻璃钢水槽的塑料大袋； 也有用土池培养的情况四）封闭式培养与开放式培养是按照藻液与外界的接触程度划分的。

封闭式培养：是把培养液密封在透明的容器中，与外界隔离培养容器多为管 状，用有机玻璃或透明的聚乙烯塑料做成管道，水平、直立或斜立于地上，暴 露在阳光中（或用日光灯光源），二氧化碳完全采用人工供给的办法，并利用 水泵使培养液不断循环完全封闭式培养所用的设备主要包括培养槽、气体交 换塔和控制系统三部分，其优点是容易控制，产量稳定，但设备成本较高目前国内采用的玻璃柱和塑料袋培养，效果很好具有方法简单、成本低、培 养的藻细胞密度大、不易被污染、生产周期短等优点开放式培养：是把微藻培养在敞开的容器中二氧化碳采用人工供给或依靠与 空气的自然交换，如常见的广口玻璃缸、水族箱、玻璃钢水槽、水泥池培养等 开放式培养设备简单，成本低，是目前培养微藻的主要形式开放式培养由于 光照充足，通风较好，藻细胞生长繁殖迅速，但因藻液与外界接触面大，容易 受敌害生物污染二、培养方法二、培养方法微藻培养的一般方法为：容器、工具的洗涤和消毒，培养液的制备，接种，培 养管理一）容器、工具的洗涤和消毒培养用容器、工具的洗涤和消毒是微藻培养中最基本的一项，稍有疏忽就会引 起藻种间的混杂和敌害生物的污染，造成整个培养工作失败，因此必须引起足 够的重视。

所有培养用容器、工具都必须在用前用去污粉、洗液或肥皂粉等刷洗并冲洗干 净，如果玻璃瓶壁上有白色菌膜或碳酸钙等物粘附，不易刷洗，可用 1%浓度 左右的稀盐酸浸泡去除，然后用水冲洗容器、工具洗刷干净后，用以下几种 方法进行消毒1、加热消毒法加热消毒法是利用高温杀死微生物的方法不耐高温的容器、工具，如塑料和 橡胶制品等不能用此法消毒1）直接灼烧消毒：接种环、镊子等金属小工具，试管口，瓶口等可以直接在 酒精灯火焰上短暂灼烧消毒载玻片、小刀等则最好先蘸酒精，然后在酒精灯 火焰上点燃，等器具上的酒精烧光，也就完成了消毒操作直接灼烧消毒可以 直接把微生物烧死，灭菌彻底优点是简单、方便、快速、效果好但只适用 于小型金属或玻璃工具2）煮沸消毒：把容器、工具放入锅中，加水煮沸消毒一般在水中煮沸 10- 20 分钟对大型锥形瓶消毒时，可在锥形瓶口放一只培养皿，然后在锥形瓶中 加少量淡水，加热煮沸完毕即用消毒纸或纱布蒙上备用煮沸消毒法的作用是杀死全部营养体的部分芽孢如果在水中加 1%碳酸钠效 果更好，此法只适用于小型的容器、工具3）烘箱干燥消毒 ：将玻璃容器、金属工具等洗涤清洁，待干燥后放入烘箱（亦称恒温干燥箱） 中，关闭烘箱，打开通气孔，接通电源，加热。

当温度达到 120 摄氏度时，关 闭通气孔，停止加热，维持 2 小时，然后关闭电源此时切不可打开烘箱门， 必须等烘箱内温度逐渐下降到 60 摄氏度以下才能打开烘箱门在消毒过程中， 温度上升或下降都不能过急，否则玻璃器皿容易炸裂2、化学药品消毒法在大规模培养微藻的生产中，大型容器、工具及培养池一般用化学药品消毒， 常用的消毒药品有漂白粉（或漂白液）、酒精、高锰酸钾等1）漂白粉[Ca(ClO)2]或漂白液：漂白粉又称氯石灰，为白色粉末状物质，是 氯与氢氧化钙作用的产物在空气中因受二氧化碳作用，逐渐放出次氯酸而有 强烈的刺激性气味工业上用的漂白烩一般含有效氯为 30%-35%，消毒时按万 分之一到三的含量配成水溶液，把容器、工具在溶液中浸泡半小时，再用消毒 水（经过煮沸或沉淀过滤的水）冲洗三四次即可白瓷砖池、水泥池的消毒可 配成高浓度浆糊状的漂白粉溶液淋洒池壁，半小时后用消毒水冲洗干净；为充 分消毒培养池，也可用较低量的漂白粉进行全池浸泡后用消毒水冲洗干净因 漂白粉有氯臭味，还需要停放 12 小时才能接种使用（一般下午消毒池子，明天 早上接种），以免抑制微藻生长使用漂白粉消毒需长时间浸泡，同时氯臭味较难除去。

漂白粉暴露于空气中易 分解，遇水或乙醇也分解，应密封储存也可用漂白精进行消毒，漂白精主要成分是次氯酸钙，一般含有效氯 70%左右， 用漂白精消毒，用量应减半漂白液含有一定量的 NaClO，是化工厂的副产物，有效氯的含量一般在 5%左 右由于漂白液具有价格低廉、无大型杂质、不产生沉淀物及便于储藏和用法 简单等优点，被育苗场广泛地用于容器、工具和培养池的消毒使用时可参照 漂白粉的用量进行具体的调整2）酒精（C2H5OH） ：酒精即乙醇酒精能使生物蛋白质脱水变性凝固，故 有杀菌作用70%酒精杀菌能力最强，常用于小、中型容器、工具的消毒方 法是用纱布蘸酒精在容器、工具的表面涂抹即达到消毒目的操作时应注意容 器、工具的表面必须全部抹到，不能遗漏如果容器水洗后还未干燥即进行消 毒，则酒精的浓度应提高，可用 90%-95%浓度的酒精，以防容器表面的酒精浓 度被水分冲淡而降低杀菌能力酒精涂抹后五分钟，用消毒水冲洗两次即可使用酒精消毒，简单方便，效果好酒精是一种较理想的消毒药品3）高锰酸钾（KMnO4）： 高锰酸钾又叫灰锰氧，为紫色针状结晶可溶于 水，是一种强氧化剂，能使蛋白质变性，杀菌能力很强消毒时按 5*10-6 的比 例配成高锰酸钾溶液。

把洗涤清洁的容器、工具放在溶液中浸泡 5 分钟，取出 用消毒水冲洗两三次即成白瓷砖池、水泥培养池的消毒，可用高锰酸钾溶液 由池壁淋洒几遍，并泼洒池底，10 分钟后再用消毒水冲洗干净注意用高锰酸钾浸泡的时间不能过长，如果超过 1 小时，容器、工具上常有棕褐色沉淀附着， 很难洗去4）石炭酸：其主要破坏生长细胞膜，使蛋白质变性消毒时按 3%-5%的比 例配成溶液，把洗涤清洁的容器、工具在石炭酸溶液中浸泡半小时，再用消毒 水冲洗两三次即成5）盐酸：取工业用盐酸 1 份加淡水 9 份配成 10%的盐酸溶液，把清洗干净的 容器、工具放入盐酸溶液中浸泡 5 分钟，再用消毒水冲洗 2 次即可水泥池的 消毒与使用高锰酸钾消毒方法相同二）培养液的制备微藻培养液（液体培养基）是在消毒海水中加入营养盐配制而成1、海水的消毒为了防止敌害生物污染，配制培养液的海水必须经过消毒，杀死其中的敌害生 物 培养用水常用的消毒方法有过滤、加热、化学消毒剂和紫外线消毒等几种选 用消毒方法应考虑下列三方面的情况：第一，能够达到杀灭敌害生物的目的； 第二，经消毒处理后的海水必须无毒，对培养藻类的生长、繁殖无不良影响或 影响不大；第三，水消毒方法必须经济、简单、易行，并能够供应大量培养的 需要。

目前在微藻培养中常用的水消毒方法有以下几种：（1）加热消毒法：把经沉淀的或沉淀后再经砂滤的海水于烧瓶或铝锅中煮沸消 毒海水加热消毒，冷却后须经充分搅拌或震荡，使其恢复溶解气体量通常 保种培养用水多用加热消毒法进行消毒2）过滤除菌法：把经沉淀的海水，经砂过滤装置（砂滤池或砂滤罐）过滤， 把大型的生物的非生物杂质除去，再经陶瓷过滤罐过滤，除去微小生物还有双过滤装置，使海水经过两次过滤，除菌更有保证砂滤装置，滤水迅速、滤 水量大，在微藻的大量培养中使用，能满足大量用水的需要但是微小生物不 能完全隔除，除菌不彻底是砂滤的缺点为了克服这一缺点，可采用两次砂滤、 陶瓷过滤罐过滤或进行水的再消毒处理3）酸处理消毒：海水的 PH 值呈稳定碱性，长期生活于海水环境中的海洋生 物对 PH 值变化的适应力和对酸性的耐力都较弱根据这个原理，可使用酸处 理方法消毒海水海水经沉淀及砂过滤装置过滤后流入海水消毒池，用酸处理 方法消毒具体做法如下：酸碱溶液的配制： 1）量取浓盐酸 84 毫升，加蒸馏水（或用淡水代替）916 毫 升，配成一个摩尔浓度的盐酸溶液 2）称取氢氧化钠 40 克，溶解于 1000 毫 升蒸馏水（或用淡水代替）中，配成一个摩尔浓度的氢氧化钠溶液。

酸处理：根据所需处理水量的多少，按每 1000 毫升海水加一个摩尔浓度的盐酸 溶液 3 毫升的比例，加酸充分搅拌加酸后海水的 PH 值可降到 3 左右（PH 值 2.9-3.1)酸处理 12 小时以上，一般下午开始酸处理到次日上午止处理完毕， 再按每 1000 毫升海水加入一个摩尔浓度的氢氧化钠溶液 3 毫升的比例，加碱中 和，使海水的 PH 值恢复到 7.5-8.0 左右然后立即施肥，接种培养4）漂白粉或漂白液消毒：海水经沉淀及砂过滤装置过滤后流入海水消毒池， 使用漂白粉或漂白液消毒目前生产上最常用的是漂白粉[Ca(ClO)2] 和漂白液 （ NaClO）漂白粉起消毒作用的成分是其中所含的有效氯市面上出售的漂 白粉，其有效氯含量一般为 30%-35%，漂白精的有效氯含量一般为 60%-70%， 比漂白粉高一倍但这种氯含量极不稳定，易与空气中的二氧化碳化合而不断 消失，同时也容易从空气中吸收水分而潮解成半流动体，并很快分解产生次氯 酸而散逸如果产品出厂后经过的时间较长，储藏又不严密，就很容易失去消 毒作用因此在使用时，若不预先测定其有效氯含量，而仅以出厂时标明的氯 含量来计算漂白粉使用量，往往达不到预期效果。

消毒时，直接向水中加入漂白粉或漂白液，使有效氯含量达到 25×10-6左右，停 放 6-7 小时，可将水中的细菌、杂藻、原生动物等杀死 使用前，需要用硫代硫酸钠（Na2S2O3)进行中和在生产上用硫酸——碘化钾 ——淀粉试剂作为指示剂，先计算出理论上所需硫代硫酸钠的量，将此数据作 为参考，逐渐往里加，边加边搅动，加到一大半时，用指示剂测定，若变成蓝 色，则说明还有余氯需要继续中和；当滴加指示剂无兰色。