PCR常见问题分析及对策（无扩增产物.非特异性扩增、拖尾、假阳性）.docx

PCR常见问题分析及对策（无扩增产物.非特异性扩增、拖尾、假阳性）问题1：无扩堆产物现象:正对照有条带,而样品則无原因：仁模板:含右抑制物，含就低2・Buffe「対样品不合适3 •引物设计不当或者肢生降解4仮应条件：退火淑度太直.矩伸时间太短对策:1・纯化模板或者便用试剂盒捉取模板DNA或加大模畋的用城2•里换Buffer或调整浓度3・重新设计引物（避免链间二聚休和谨内二级结构）或者换一管新引物4•降低退火淑沒、包长延伸时间M 样品样品正对照何题2：非特异性扩増现彖：条带与顶计的大小不-致或者非特异性扩增带贩因：1・引物特界性并2 •模板或引物浓度过高3 •冊駅过多4・Mg2+浓度偏高 5 •退火洽度偏低6 •術环次数过多对策：1 •重新设计引物或者使用巢式PCR2 •适舟降低模板或引物浓度3 •适当减少簡虽4 •降低钱离子浓页5 •适当提高退火温度或使用.阶段泪巫法6 •减少術环次数问题3：拖尾现©:产物在筱胶上呈Smear状态.原因:1 •模板不纯2. Buffer不合适3 •追火淋度備低4 •酶最过多5.dNTP、Mg黔浓度俯高6 •街环次数过多对策:1 •纯化模板2•史换 Buffer3 •适十炎简退火淋度4 •适量用晦5•近十好低dNTP和钱离子的浓度6 •减少循环次数问JK4：假阳性现徐：空白対照出现目的护增产物原因:耙序列或扩增产物的交•污染对策：1・操作时应小心轻柔.防上将杷序列吸入加样枪内或澱出离心停外：2•除酶及不能ami的物质外，所有试剂或器材均应高压消髯&所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3•各种试剂最好先进行分装,然后低淋!r存PCR产物的电沐检测时何•一般为48h以内，有令址好丁当I I电泳检测，大丁 48h后帯型不规则战致消失假阴性，不岀现扩増条带pcr反应的关键环节冇①模板核酸的制备，②引物的廣徹与特异性，③闸的廣掀及，④pcr循环圣fq“寻找腹因亦应什对上述环节进行分析研究•模板：①模板中含有朵贺白质，②模板中含1i Taq tii抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除谡，特别是染色休中的flUHl-l,④在捉取制备模板时丢失过多， 或吸入阱，⑤模板核酸变性不彻底在酹和引物质屋好时，不出现扩增带，极有可能是标木的消化处理，模板核酸捉取过稈出了毛病，因而翠配制有效而稳 定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改.曲失活：盂更换新曲，或新旧两种曲同时便用，以分析是否因检的活性丧失或不够而导致假阴性.需注意的是右时忘加Taq的或視乙锭引物：引物质SL引物的浓度、却条引物的浓度楚否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥敝的帘见原因.有些批号的引物合成质厳有问题，两条 引物…条浓度 轧一条浓度低，造成低效率的不对称扩熠，对笫为：①迭定一个好的引物合成单位②引物的浓度不仅耍看ODtfi,更耍注重引物底液做琼 胶电泳，一定耍有引物条带出现•而且两引物帯的亮度应大体一致，如一条引物有条帯.一条引物无条帯•此时做PCR有可能失畋，应和引物合成单 位协商解决，女山条引物晓度烏，•条晓度低，左稱释引物时耍平衡其浓度•③引物应高浓度小址分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷峨部分，导致引 物变质降解失效，④引物设计不合理■如引物长度不够，引物Z间形成二聚体暫.Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩熠效率影明很九 浓度过窩可降低PCR扩増的持 异性，浓復过低则影响PCR扩熠产按披至使PCR #增失败而不出 扩增条带。

反应体积的改处 通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30uk 50ul°或100ul,应用多大体积进行PCR》％,是根据科^研和临床检测不同目的而设定, 在做小体积如20ul后，再做大体积时.一定耍模索条fl.否则容易失败物理原因:变性对PCR扩增来说相当臣耍,如变性温度低,变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低•可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率遇 火泪復过;為紺响引物打槐板的结合而降低PCR V 1«效率•有时还有必要用标卅的温度计，検测一卜扩増仪或水密闵内的变性、退火和矩伸淋滾，这也是PCR 失畋的原因之一靶序列变界：如靶序列发生宝变或缺失，够响引物与模板符界性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR衲増是不会成功的假阳性岀现的PCR扩增条带与目的祀序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高.引物设计不合如 选斧的扩増序列与非目的扩増序列有同源性，因而在进行PCR IJ、増 皿扩増出的PCR产物为非目的性的金列耙序列&矩或引物太短， 容易出现假阳性需兎新设计引物.靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个也因细或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以卜方法解决：①探作时应小心 轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出旖心管外•②除刖及不能耐高洱的物质外，所有试剂或器材均应高压消济•所用廉心符及样进枪头零均应•次性便 用.③必要时，在加标木前，反应骨和试剂用紫外线鹽射，以破坏存在的核酸“二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比耙序列短，但有一定的同源性. 可互相拼接,与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来幘轻威消除出现林异性扩增带PCR扩增后出现的冬帶与读计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增帶与井特异性扩堆帶「恭特异性条帶的出现，其瓯因：一是引物与靶序 列不完全互补、或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+离子浓滾过窩、退火温度过低，及PCR術环次数过多有关・英次是鮒的质和最，往往一些来源的的易岀 现非特异条带而另一来源的酶則不出现，猗疑过多有时也会出现非待异性扩増其对策有:①必耍时垂新设计引物②械低I®最或调换另•来源的叔 ③降 低引物星.适当增加模板星.碱少術环次数，④适当提馮退火泪度或采用二泪度点法（93t变件.65C左右退火与延伸）出现片状拖带或涂抹带PCR扩増冇时出现涂抹带或片状带或地您样带。

其原因往往由丁爾量过$或商的质疑并，dNTP浓度过高，Mg2•浓度过高，退火湍度过低，循环次数过多 引④ 其对策有：①减少悔罐,或训换另来源的條 ②减少dNTP的浓度③适当降低Mg2■浓度④增加模板舐 减少術环次如克隆PCR产物I的最优条件是什么?蹑佳插入片段：载体比需实验瑚定.1： 1 （插入片段：载体〉常为垠佳比，呼尔数比4： 8或& 1也行•应测定比值范用连接用5ul2X迓接液,50ng质 粒DNAjWeiss单位的T4连接酶,插入片段共10uL室沿保沿4小时，或4oC过夜在这2种温度卜,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑室温保温1 小时能满足大多数克降耍求，为提岛连接效率，需4oC过夜PCR产物是否带耍用凝胶纯化？如腹胶分析扩増产物只有一条带，不需耍用凝胶纯化・如可见其他朵带，可能是积累了犬欣引物的二聚f札 少瑕的引物二聚体的廉尔数也很髙，这会产生高 比例的帯冇引物二聚休的克降，而非目的插入片段为此需在克隆前做腹胶纯化.如果没有回收到目的片段，还潘耍作什么対照实验？A） 涂布未转化的感受态细胞，如有苗落，农明氮节失效，或污染上帯有冕节抗型的质粒，或产生氮荣抗型的爾落.B） 转化完熬质札 计算菌落生长数，测定转化效率•例如 将1ug/ul质粒1:400晞陥W用丁JOOul感受态细胞转化•用SOC稀释到1000ul ，用100ul 備板.培养过夜，产生1000个茵落，转化率为：产生曲落的总数/術板DNA的总量。

抽板DNA的总虽是转化反应所用的晁除以稀释倍数具体而言转化用 10ng DNA,用SOC桶释到1000u后含10 ng DNA, Jfl 1/10抽板，共用1 ng DNA：转化率为:1000克隆X10 （3次方）ng /備板1 ng DNA ug=10（6次方） cfu/ ug转化pGEM-T hV用10 （8次方）cfu/ug酒受态细胞如没有曲落或少竹询落.感受态细胞的转化率太低C） 如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生＞20-40 珂（用指定步MM0（8次方〉cfu/ug感受态细胞），表明戎体失去「可能足连接的污染了核战札 T4 DNA连接脇（M1801, M1804, M1794 ）质於标准好无孩酸M污染，不应用其它来滩的T4 DNA连接的替换.D） 用pGEM-T或pGEM・TEasy我休，连接pGEM・T正対照，转化岛倾率感受态细脸（10 （8次方）cfu/ug）,按照折定的实验步照町得100个苗落，其 中60%应为白坍，如产生＞20・40麓斑，没有苗落或少有苗落，连接有问题对照实验结果好，却没有回收到H的片段，实验出了什么问题？A） 连接用峑泪保泪1小时，能滿足大多数克隆，为捉高效率，需4oC过孜，B） 插入片段带有污染,使3、・T缺失，或抑制连接，抑制转化・为此，将插入片段和pGEM-T iE对照混合.再连接•如降低了对照的菌落数,插入片段需 纯化，或重新制备：如产生大疑的麓斑，插入片段污染冇孩酸瞰 使pGEM-T或pGEWTEasy裁休3、・T缺失。

C） 插入片段不适丁•连接用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生UV过度照射会产生喘咗二聚休，不利丁连接，DNA必需車新纯化D） 带有修复功能的耐热DNA聚合鮒的#型产物末端无A・后者是pGEM・T或pGEM・T Easy战休克隆所需加Taq DNA聚合也和核卫酸可在末端加A pGEM-T pGEM-T Easy ^（4技术资料（TM042）.E） 岛度重烫序列可能会不趙定，在扩熠中产生缺失和扈排，如发现插入片段高频率地产生缺失和車排，需用扈织缺陷大肠杆苗苗株，如SURE细胞PCR疑难解答当PCR结果不甚满邀时，首先检沓以卜儿方面力遵照执行：将PCR反应的试耸与反应板紧贴.当信反应混合物以70C热启处开始循环时，切记在加入像品稍微抿荡一卜，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热不耍随恿减少dNTP的用址，它是一个系统的因第，必须与其它成份保持平術对丁有何題的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taqfif/t的休系进行预变性，后加模板进行正常PCR F增&没有扩増产物： 在捉供MgCI2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCI2浓度：无MgCI2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度瑕加MgCI2浓滾. 泳逍中出现模糊条带,如果DNA模板中存在RNA,则按上述提示浓度补加MgCI2. W为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+&检杳退火羽度和变性条竹・如果有需耍的话，可降低iU火泪度•检資模板和引物的用址.熠加循坏次数和/或枳板DNA的用於.泳道中出现模糊条带:减少術环次数或模板DNA的用量。

提高退火羽度，但不耍超过68匸產新设计引物或设计更长的引物•其他佰御注意的釜竹:建议使用0.2-ml薄壁竇"壁竇在929'时不能冇效地使模板变竹，垠佳反应体积为50mh推荐用30ml W物油覆蔷（对蔷子加热的PCR仪可以不加〉大多数反应中，0.75ml 10.5-1 ml）的检址在大多数恰况卜可以得到满意的结果•建议纯用1.75mmol/LMgCI2 : 350mmol/LdNTP 2.25mmol/L MgCI2 : 500mmol/L dNTP纽合的混仑物然而耍衍到址仕结果，优化Mg2+的浓度是必需的基因纠DNA模板的质ht显弄够响PCR反应.因此押疔使用琼脂軸礙胶电沐来检测DNA的长％ DNA片段长度町以超过50kb・传统的臬因组DNA能扩増片段至10。