生化分离思考题3.docx

成，仅供参考，如有错处之处，请见谅! 章1. 名词解释：分离度，凝胶过滤层析，离子交换层析，疏水性作用层析，反相层析，聚焦层析，羟基磷灰石作用层析分离度是色谱分离中用来表达两个洗脱位置的相邻溶质相互分离程度的概念，是两个相邻洗脱峰之间的距离与两 个峰宽的代数平均值之比凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等，是利用凝胶过滤介质 为固定相，根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离的液相层析法离子交换层析是利用离子交换剂为固定相，是根据荷电溶质与 离子交换剂之间静电相互作用里的差别进行溶质分离的洗脱色谱法疏水性作用层析是利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸 附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子的分离纯化的洗脱方法反相层析是利用表面非极性的反相介质为固定相，极性为有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性） 的差别进行分离纯化的洗脱色谱法色谱聚焦层析是基于离子交换的原理，根据两性电解质分子间等电点的差别进行分离纯化的洗脱色谱法羟基磷灰石（HAP）作用层析是利用HAP的片状晶状颗粒为固定相分离纯化蛋白质，基于Ca2+和PO 3-的静电吸附能4力的液相层析方法。

2. 按流动相和固定相的不同，层析法分哪几种类型？（1） .根据流动相相态的不同：气相层析、液相层析、超临界流体层析（2） .根据固定相形状：纸层析、薄板层析、柱层析3. 凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水性作用层析、反相层析、聚焦层析和羟基磷灰石作用层析都采用哪些洗脱剂? 采用怎样的洗脱方法？洗脱剂 洗脱方法凝胶过滤层析禺子交换层析1•连续梯度洗脱：洗脱剂的pH或离 子强度成梯度连续变化2•逐次洗脱法：分次将不同pH与禺 子强度的溶液加入，使不同成分逐步 洗脱疏水性作用层析高浓度盐溶液降低流动相离子强度的线性梯度洗脱 法或阶段洗脱法，需适宜的配基修饰 密度反相层析极性有机溶剂（如甲醇、乙腈）或其水溶液采用降低极性法聚焦层析多元缓冲溶液首先用高pH溶液平衡，然后用多元缓 冲液进行洗脱，多元缓冲液pH呈梯度 下降羟基磷灰石作用层析磷酸盐缓冲溶液米用高盐浓度的线性梯度洗脱法4. 逐次洗脱和梯度洗脱的优缺点？1•连续梯度洗脱：洗脱剂的pH或离子强度成梯度连续变化 优点：流动相离子强度连续增加，不出现干扰峰，操作范围广 缺点：需要特殊的调配浓度梯度的设备2•逐次洗脱法：分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。

优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不需要特殊设备，操作简单缺点：易出现干扰峰，易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作的参数（如盐浓度，体积）的设计较困难5. 凝胶过滤层析的优缺点和应用？凝胶层析优缺点优点：（1） 恒定洗脱；（2） 不需清洗或再生；（3） 脱盐比透析法快，比超滤的剪切应力小，蛋白活性高；（4） 机理简单，易放大缺点：（1） 依分子量分离，选择性低，料处理量小；（2） 产品被稀释，须浓缩产品凝胶层析的应用（1） 用于分离纯化：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯凝胶对热 原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水2） 脱盐：本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性适用的凝胶为SephadexG-10、15、25 或Bio-Gel-p-2、4、6柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25%-30%，为了防止蛋白质脱盐后溶解度 降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱, 收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类3） 测定高分子物质的分子量用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分 钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直 线，即分子量的标准曲线。

测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线 的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量V0空隙体积，一般是用平均相对分子量为2000 kDa的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran） 来测定4）高分子溶液的浓缩通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔 隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液6. 如何用凝胶过滤层析测定多糖的分子量?用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成 分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线， 即分子量的标准曲线测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝 胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量V0空隙体积，一般是用平均相对分子量为2000 kDa的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran） 来测定第辑而成，仅供参考，如有错处之处，请见谅!章1. 名词解释：凝胶电泳、凝胶电泳：主要利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离的区带电泳分离方法。

在凝胶电泳过程中， 相对分子质量大的溶质受凝胶阻滞作用大，电泳速度慢，而相对分子质量小的溶质的电泳速度快经过一段时间的电 泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中会形成含有不同溶质的区带，实现溶质之间的相互分离2. 电泳的分类中，按有无支持物可分为：自有电泳和支持物电泳，支持物电泳按支持物材料的不同又分为哪几种？（1） 纸电泳（2） 醋酸纤维薄膜电泳（3） 粉末电泳：如淀粉，纤维素粉，玻璃粉（4） 凝胶电泳①淀粉胶②聚丙烯酰胺凝胶（普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸）③琼脂（糖）凝胶（孔径 较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广）5） 缘线电泳:如尼龙丝，人造丝电泳3. 影响电泳迁移率的因素有哪些？1. 电场强度：电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度电压在500V以上，电场强度在2-10v/cm时为常压电泳电压在500V以上，电场强度在20-200V/cm时为高压电泳 电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温聚丙烯酰胺凝胶 电泳和SDS电泳需要200〜600V电压2. 溶液pH （分子电荷）3. 离子强度：电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。

其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其 周围，形成一个与运动质点符合相反的离子氛（ionic atmosphere）,离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前 移的阻力，甚至使其不能泳动然而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响 质点的带电量，改变泳动速度4. 电渗：在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离 的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸 附0H-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H30+,带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表 现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持 物以减少电渗的影响带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反v电渗流〉v电泳时，阴离子在负极最后流出，在这种情况下,不但可以按类 分离，除中性粒子外，同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。

4. SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量，其中SDS的作用是什么？作用：消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用原因：SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物由于结 合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了从而起到消除各蛋白 质分子之间自身的电荷差异的作用5. 如何用SDS-PAGE法测定蛋白质分子量？6. 解释不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理本实验采用不连续的聚丙烯酸胺凝胶电泳分离小麦苗过氧化物酶同工酶系统的不连续性表现在以下几个方面：（1）凝胶层的不连续性：凝胶由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的 分离胶2） 缓冲液离子组成及各层凝胶的pH的不连续性：本实验采用碱性系统，电极缓冲液为pH8. 9的Tris — HCl缓冲液， 浓缩胶和分离胶缓冲液均为Tris 一 HCl缓冲液，但pH值分别为6.7和& 93） 电位梯度的不连续性：由于pH的不连续性，在电场中形成了不连续的电位梯度详见后述）在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。

在这三种效应的共同作用下, 待分离的物质很好地分开下面以要分离的小麦过氧化物酶同工酶为例，分别说明这三种效应的作用：（1） 电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动2） 分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快，反之，分子量大，形状不规 则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢3） 浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩其原因如下①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢这样，就在两层凝胶交界 处使待分离的酶蛋白区带变窄，浓度升高②在聚丙烯酰胺凝胶板中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液， 但上层浓缩胶的pH为6.7,下层分离胶的pH为& 9HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl-布 满整个胶板待分离的酶蛋白样品加在顶层，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液中电泳一开始，有效泳动率最大的 Cl-迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）在pH6.7条件下解离度仅有0.1T.0%的甘氨酸有效泳动率最低，跑在 最后边，成为慢离子（尾随离子）。

这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面在pH6.7条件下带有 负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带由于快离子快速向 前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区因为电位梯度V、电流强度1和电导率S之间有 如下关系：V = I / S所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋 白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成 一条更为狭窄的区带这就是所谓的浓缩效应在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶 前被逐步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”后来，当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为& 9,甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大到超过所 有酶蛋白分子，从而赶上并超过所有酶蛋白分子此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位 梯度不再存在于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在。