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    外泌体RNA作为胃癌诊断生物标志物的研究进展    邓柯 综述 刘琦,彭湃澜 审校胃癌是第五大最常见的癌症,也是导致癌症死亡的第三大原因[1]胃癌早期通常缺乏明显症状,而患者出现典型症状后往往已达到中晚期,此时患者的存活率很低,其5年存活率低于20%而早期胃癌的5年生存率可达90%以上[2]因此早期诊断能显著提高胃癌患者的生存率目前早期胃癌的诊断方法仍主要是内镜检查和活检,但内镜检查有着一定的漏诊率[3-4],以及具有侵入性和组织样本有限等缺点,而肿瘤生物标志物以其安全性高及可重复采集,便于动态监测等优点,相较于内镜及活检更易被受检者接受因此液体活检成为胃癌早期诊断的一种有前途的检测手段,故寻找特异性和敏感性均高的胃癌生物标志物对于胃癌患者早诊断有着重要意义1 外泌体(Exosomes)外泌体于1983年由Pan和Johnstone等首次发现[5],是几乎所有正常细胞和肿瘤细胞分泌的一类直径在30～150 nm的膜结合双层脂质囊泡,与细胞质膜融合后从多种细胞中释放到细胞外[6],广泛分布于体液中,如血液、尿液、唾液、脑脊液、胆汁、母乳、精液等[7],其内包括蛋白质、代谢物、脂质、氨基酸、多种RNA等物质[8],外泌体RNA包括长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)等[9],外泌体通过将其内容物传递到受体细胞来参与细胞间通讯,肿瘤细胞分泌的外泌体通过促进癌症增殖,抑制细胞凋亡,建立转移前的生态位,在细胞间传递信息以及调节耐药,在恶性肿瘤中起着关键作用。

Liu等[10]研究发现肿瘤细胞产生的外泌体比正常细胞多约10倍,导致患者体液中外泌体的浓度显著高于正常人传统生物标志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、CA199(carbohydrate antigen 19-9)、CA724(carbohydrate antigen 724)的敏感度及特异度均较低[11-12],而外泌体作为双层脂质囊泡,可保护其转运的RNA免受核酸酶的降解,并且在各种温度和pH条件下保持稳定,因此肿瘤细胞分泌的外泌体可以较准确地反映癌症的发生及其发展变化,外泌体检测具有快速精确、采集方便、可重复采集、疼痛小、能够追踪肿瘤进展等特点[13-14],是可运用于临床的理想液体活检技术,因此外泌体作为以非侵入方式进行癌症诊断的生物标志物具有重要临床前景2 长链非编码RNA(lncRNA)lncRNA是一组长度超过200个核苷酸的非编码RNA,在转录和转录后水平调控多种细胞功能,lncRNA通过基因表达调控肿瘤的发生及进展lncRNA作为癌症生物标志物,在胃癌组织及体液中大量表达,大量研究表明循环lncRNA可作为胃癌诊断的生物标志物[15]。

Cao等[16]发现lncRNA在胃癌组织中表达具有差异性,大部分的lncRNA表达上调Xiao等[17]在进一步研究胃癌中lncRNA的表达时,检测到520个lncRNA差异表达,其中有328个表达上调,192个表达下调,且通过对差异表达的lncRNA进行层次聚类分析,结果表明差异表达的lncRNA可以准确地区分出正常组织和癌症组织Guo等[18]研究表明总循环lncRNA-GC1几乎都包含在外泌体中,且循环外泌体lncRNA-GC1的水平与胃癌组织中表达一致这或许提示检测胃癌患者循环中的外泌体长链非编码RNA表达水平,相对于检测胃癌组织同样具有诊断意义Zhou等[19]计算出循环外泌体lncRNA H19的ROC曲线下面积(AUC)为0.849,高于传统的生物标志物CEA(0.721)、CA72-4(0.588)、CA199(0.640),且外泌体lncRNA H19联合以上3种传统胃癌生物标志物诊断胃癌的AUC为0.864,与单独检测外泌体lncRNA H19的AUC(0.849)并没有显著的差别这表明外泌体lncRNA H19诊断胃癌患者的能力明显优于传统的胃癌生物标志物,意味着其可能成为未来的胃癌诊断标志物。

Guo等[18]发现循环外泌体lncRNA-GC1水平与胃癌分期有显著关系,随着分期的递增lncRNA-GC1水平逐渐升高(HD与Ⅰ期,t=20.98,P<0.001)及健康对照组(P3 微小RNA(miRNA)miRNA是一种具有17～25个核苷酸的内源性短链非编码RNA,直接通过与靶向mRNA的3’-UTR中的互补序列结合,来调节相应的mRNA降解抑或翻译,miRNA在细胞的增殖、分化、转移、凋亡等过程中起着重要的作用[28]Ge等[29]研究表明在血清外泌体中的miRNA中有136个miRNA表达水平上调和170个miRNA表达水平下调研究表明胃癌患者在出现临床体征或异常影像学之前,外泌体miRNA在血源性转移胃癌患者中就已经失调了[30]Shi等[31]通过实验发现血清外泌体miR-1246表达水平增加可以区分TNM Ⅰ期胃癌患者与健康对照及良性疾病患者,AUC分别为0.843和0.811Tang等[32]经研究得出外泌体miRNA let-7g-5p在鉴别早期胃癌与健康对照组的AUC为0.756(95%CI0.659～0.892,临界值<4.184,敏感度54%,特异度88%),明显高于CEA的AUC值(0.520,95%CI0.405～0.635,临界值<0.001),而当患者行胃切除术后血清中外泌体miR-215-5p的水平显著降低(P<0.001)。

因此当血清外泌体miRNA在手术治疗后明显下降甚至正常,则提示预后好,而当下降后又再次升高,则可能提示复发,预后则较差Wang等[35]研究得出血清外泌体miR-10401-3p、miR-1255b-5p、miR-6736-5p在胃癌患者组表达水平显著下降(P<0.001)、miR-6736-5p的AUC为0.814(P<0.001),证明了血清外泌体作为胃癌诊断的生物标志物的巨大潜力Zheng等[36]的研究表明,血清外泌体miR-590-5p在胃癌患者表达水平显著降低,在健康对照组、早期(Ⅰ、Ⅱ期)、晚期(Ⅲ期)中的血清外泌体miR-590-5p表达水平分别为30.34±6.35、6.19±0.81、2.90±0.19(均P<0.05)表明其表达水平与胃癌患者的分期呈负相关,不仅有利于胃癌患者的早期检测,还利于对胃癌患者进行病理诊断分期相关研究表明外泌体miRNA-3184-5p可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,但胃癌患者中的外泌体miRNA-3184-5p表达水平下调,以致于抑制胃癌细胞生长的作用减弱[37]Jin等[38]指出胃癌患者血清外泌体miRNA-134表达水平降低,而表达低的患者的总生存期及无复发生存期较短。

表明检测外泌体miRNA表达水平对于判断机体是否患有胃癌及预后具有重要临床意义4 环状RNA(circRNA)环状RNA是一种非编码的共价闭环内源性RNA,于1970年由Sanger等[39]在RNA病毒中发现和鉴定,由于其没有5’帽端及3’聚(A)尾,因此对RNase R和其他核酸外切酶具有抗性而稳定存在环状RNA主要通过作为转录调节因子、miRNA海绵以及与蛋白质相互作用而发挥其主要作用[40]环状RNA在胃癌细胞的增殖、凋亡等过程中发挥重要的作用,因其高度稳定性及广泛分布于外泌体中,环状RNA在作为胃癌生物标志物方面具有巨大潜力[41],其中hsa_circ_0074362、hsa_circ_0000096、has_circ_0061276、has_circ_0001017、circNRIP1、cricKIAA244、circPSMC3、circ133、cricPVT1、circAKT3、circDONSON、circPVRL3等已被作为筛查胃癌的潜在生物标志物[42]Lu等[43]发现circ-RanGAP1在胃癌组织及胃癌患者的血浆外泌体中表达量均显著上调Shi等[44]表明胃癌组织中的circ0088300表达水平与在血浆外泌体中的表达水平相对应。

同样Xie等[45]证明circSHKBP1在胃癌组织中的表达量较正常组织高2.31倍(P<0.05)Zhang等[47]根据实验数据得出血清hsa-circ-0007507诊断胃癌的AUC值为0.832(95%CI0.771～0.892,P<0.001,敏感度73%,特异度85%),高于传统生物标志物CEA的AUC值(0.765,95%CI0.697～0.833,P5 结 语胃癌仍是世界上发病率和病死率均较高的恶性肿瘤之一,胃癌的早诊断对于患者的早治疗至关重要近年来,液体活检作为一种非侵入性肿瘤筛查方法受到了极大的关注,检测体液中的外泌体RNA表达水平在胃癌患者的早期发现、评估分期、治疗评估、监测复发和预后评估中具有重要的意义但目前临床上仍缺乏特异度及敏感度都较高的外泌体RNA作为生物标志物有研究表明联合检测不同的肿瘤标志物能提高胃癌早期诊断的阳性率[55],也可以准确地判断胃癌的迁移和侵袭、预后等因此迫切需要开发出常规的、无创的、具有高度组织器官特异性的外泌体RNA生物标志物,以早期诊断胃癌并指导治疗,提高患者的生存率及改善预后今后对于胃癌外泌体RNA生物标志物的研究可从以下方面发展:通过大规模的临床试验寻找并且验证高特异度及高敏感度的外泌体RNA生物标志物;找到针对癌症不同病理类型的更加特异的外泌体RNA生物标志物;联合检测不同的胃癌生物标志物对胃癌进行诊断等。