角蛋白的生物降解.ppt

角蛋白的生物降解作者：徐升胜导师：崔为正日期：2005.4.11角蛋白的来源n角蛋白（keratin）是一种纤维状蛋白质（fibrous protein），它来源于外胚层细胞，包括皮肤及其衍生物，是外胚层细胞的结构蛋白角蛋白的分类地位n在按分子结构的分类中，角蛋白属于单纯蛋白中的硬蛋白（scleroprotein）n在按生物学功能的分类中，角蛋白属于结构蛋白（structural protein） 角蛋白的分类n角蛋白是毛发中的主要蛋白质n角蛋白是蚕丝和蜘蛛丝的一种主要蛋白质n角蛋白拉伸两倍，既可形成角蛋白，外力撤消后回复n天然角蛋白不能转化为角蛋白角蛋白 的结构n氨基酸序列是由富含螺旋的中央棒状区和两侧的非螺旋区构成螺旋轴向大体上与角蛋白的长向平行在毛发角蛋白中，三股右手螺旋向左缠绕拧成一根称为原纤维（protofibril）的超螺旋结构，原纤维再排成“9+2”的电缆式结构，称为微纤维（microfibril）成百根微纤维再结合成一不规则的纤维束，称为大原纤维（macrofibril），它是毛发的结构单元 角蛋白 的结构n丝心蛋白是典型的反平行的折叠片结构，多肽链取锯齿状折叠结构，在这种构相中侧链交替的分布在折叠片的两侧。

链间主要以氢键连接，层间主要依靠范德华力维持 角蛋白生物降解的研究历史n1899年Ward报道了真菌马爪甲团囊菌(Onygena equina)能分解角蛋白n1963年Nickerson等将具有分解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶（keratin） 降解角蛋白的微生物细菌n1990年Williams等报道,从实验室废水消化器中富集分离到一株能利用羽毛的地衣芽孢杆菌PWD-1n1993年Atalo和Gashe分离到一株能降解不同纤维性蛋白的嗜热杆菌P-001An1996年Frederich报道分离到一株利用羽毛角蛋白的嗜热厌氧菌闪光杆菌降解角蛋白的微生物放线菌n1993年丁正民等从鸡毛堆肥中采样, 分离纯化到一放线菌菌株SS-1,发酵5d就不见成形鸡毛n1999年Chitte等报道分离到一株降解羽毛角蛋白的嗜热链霉菌SD8n1997年BrigitteBockle利用链霉菌降解羽毛,4d内达6.7g/L降解角蛋白的微生物真菌n1980年Jain和Agrawal研究发现Verticilliu mtenuips和Trichopyton equinum有较高的羽毛降解能力n1993年罗文等从土壤中分离出一株能降解羽毛粉角蛋白的霉菌,初步鉴定为串孢属菌(Catenu-laria sp.)。

n1995年Singh等研究了21种真菌,发现其中Trichophyton simii降解羽毛角蛋白的能力最强n1996年Santos10报道了分离到降解羽毛角蛋白的曲霉(Aspergillus fumigatus)地衣芽孢杆菌PWD-1(一)n分离材料利用喜温微生物消化禽类废弃物生产沼气的消化器产生的费液n培养基（gL）NH4Cl 0.5；NaCl 0.5；K2HPO4 0.3；KH2PO4 0.4；MgCl6H2O 0.1；酵母粉 0.1；琼脂 20；pH 7.5；羽毛粉末地衣芽孢杆菌PWD-1(二)n将反应器产生的费液接种在浸有羽毛的基础盐培养基中，在50条件下培养710天，羽毛严重降解后，转接到新的培养基中连续转接多次，大约经过数月时间n在营养琼脂上分离，至少得到两种在形态上不同的菌落其中一个为杆菌；另一个为球菌虽然两者都有降解角蛋白的活性，但以杆菌的降解活性为强地衣芽孢杆菌PWD-1（三）n有活性的微生物在500ml含有1羽毛的基础盐培养基中发酵三天，用四层粗棉布过滤，所得细胞溶于基础盐，接种于10ml含有1羽毛的培养基分别于有氧或无氧条件下培养n该微生物在无氧条件下有更强的羽毛角蛋白降解活性。

降解角蛋白的酶n1992年Xiang Lin等报道,从地衣芽孢杆菌PWD-1菌株降解羽毛的培养液中提取到一种角蛋白酶n1995年Bockle等报道,从角蛋白降解菌密旋链霉菌提纯到一种丝氨酸蛋白酶n1996年Friedrich报道:从嗜热厌氧菌闪光杆菌中,纯化到一种角蛋白酶n1999年Lgnatova等报道,从嗜热放线菌中提纯的一种单体角蛋白酶角蛋白酶的纯化（一）n用玻璃丝过滤，除去未降解的角蛋白等固形物n用0.45m孔径的滤膜过滤除去菌体及细胞碎片等n所得滤液用截留分子量为10，000的透析膜透析角蛋白酶的纯化（二）n用羧甲基纤维素进行柱层析先用pH5.8的磷酸盐缓冲液平衡加样量为50mg，依次用pH5.8、6.2、6.8的磷酸盐缓冲液进行洗脱洗脱温度为4，速度为0.4mlmin每5ml收集一份洗脱过程中通过A280进行检测角蛋白酶的纯化（三）n用交联葡聚糖G75进行柱层析对于收集到有蛋白酶活性的部分，用截留分子量为10，000的透析膜透析后，用交联葡聚糖G75层析，洗脱液为pH7.0的50mM的磷酸盐缓冲液，洗脱速度为0.3mlmin洗脱温度为4每3ml收集一份蛋白酶活性的检测n牛奶琼脂糖碟法将1g琼脂溶于98ml pH7.5的0.5mM磷酸盐缓冲液中，当温度降到6070时，加入2ml煮沸过得牛奶。

迅速倒入2020cm的玻璃碟中，充分凝固后81个直径为5mm的小孔加入25l的洗脱液，37保温过夜或50保温2h角蛋白酶活性的鉴定n磺胺化角蛋白法将经过球磨的角蛋白与对氨基苯磺酸和亚硝酸钠混合制备磺胺化角蛋白将5mg磺胺化角蛋白加入到1.5ml的离心管，充分溶解后，加入0.2ml酶溶液，50水浴，加入0.2ml 10的三氯乙酸终止反应，测A450，反应15min A450增加0.01为1U游离氨基酸的检测n反应底物：酪蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白和牛血清蛋白n反应体系：5mg底物，0.8ml缓冲液，0.2ml酶溶液（含8g纯酶）n反应检测：离心或过滤去除固形物后，取0.5ml加入水合茚三酮溶液显色n试验结果：这些底物均能被纯化到的酶水解酶性质鉴定n天然角蛋白酶分子量的测定，采用葡聚糖凝胶G75柱层析法n亚基分子量的测定，采用SDSPAGE电泳法考马斯亮蓝R250显色n为决定是否含有补体，进行紫外可见全波段扫描n是一单体酶，分子量33kDa角蛋白酶的分子生物学n1994年Xiang Lin等报道,编码地衣芽孢杆菌PWD-1产的丝氨酸蛋白酶的结构基因kerA的核苷酸序列kerA基因同编码地衣芽孢杆菌NCIMB6816菌株的SublitisinCarls-berg基因的序列相似性为97%。

这两种细菌的启动子、核糖体结合位点和转录终止子也相似推测的氨基酸序列表明这两种蛋白酶只有三个氨基酸不同Northern(RNA)分析证明kerA在转录水平受到调控酶氨基酸序列的测定n完整的或经过CNBr裂解的酶，进行SDSPAGE电泳，并eletrotransferred onto polyvinylidene difluoride 膜上通过埃德曼降解技术测定酶分子N端的氨基酸序列PWD1核酸的提取n基因组DNA的提取采用经典方法提取基因组DNA，并利用CsCl梯度离心进行纯化，回溶于双蒸水n全RNA的提取采用Ausubel发展的方法提取于营养肉汤或加入羽毛角蛋白的基础盐培养基培养的菌体的全RNAPCR底物的设计n通过比较该角蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的N端序列，推测出该角蛋白酶基因5端66个碱基的序列n以110碱基为正向因为，同时和一随机引物扩增下有序列n以4535碱基的互补序列为反相引物，与一随机引物扩增上游序列PCR screening of clonesnPWD1的基因组DNA经限制性内切酶Sau3A1作用后，整合到通过XhoI切开的质粒上利用N25（424）和T7或SP6做底物进行PCR。

Southern和Northern杂交nN25核苷酸序列的5端用32P标记，PCR产物加样于琼脂糖凝胶上电泳，然后转印到尼龙膜上，60至少16hn从含羽毛角蛋白培养基培养的菌体中提取的RNA，在含6甲醛的1琼脂糖凝胶上电泳，转印到尼龙膜上，与5端标记32P的PCR产物杂交测序nPCR产物和通过PCR筛选的克隆，转入到pCR质粒中，导入大肠杆菌利用经典方法进行测序角蛋白酶的固定n固定于succinamidopropylglass过量的角蛋白酶与活化的玻璃球反应，大约每1g玻璃球可固定100g酶n固定酶的检验反应体系：0.2ml固定化的酶，1.2g羽毛角蛋白或酪蛋白，12ml pH7.5的0.05M磷酸盐缓冲液每15min取一次反应液进行检测n固定结果固定化酶可以水解羽毛角蛋白和酪蛋白固定化酶的热稳定性n检验方法0.1ml固定化酶或游离酶80、90处理不同时间，冷却到50后与1.9ml酪蛋白溶液混合后，50反应30min离心后测定上清夜的A280n检验结果固定化酶有更高的热稳定性固定化酶稳定性n检测方法游离酶10或固定酶0.2ml，酪蛋白0.5gpH7.5的磷酸缓冲液50ml，加入0.02的NaN3抑制微生物生长，50保温，每24h取样一次。

n检测结果7天后固定酶仍保持40的活性，游离酶在2天后完全失活，可能是因为自身水解或变性低pH值处理n游离的角蛋白酶，2g游离酶溶于5l双蒸水，加到45l不同pH缓冲液中，室温处理30min，加入到0.45ml pH7.5的磷酸钾缓冲液再加入1.5ml酪蛋白溶液进行水解试验n固定化酶在不同pH的缓冲液中浸泡30min，用1ml pH7.5的磷酸缓冲液冲洗后重溶于0.5ml磷酸钾缓冲液并进行酪蛋白水解试验高pH值处理及不同pH处理结果n将游离酶或固定酶加入到0.01M NaOH溶液中，处理30min后，用HCl溶液中和n高pH值不降低两种形式角蛋白酶的活性，但低pH可以降低两者的活性下午好。