EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立医学论文.doc

EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立_医学论文 【摘要】 目的 构建含EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)的逆转录病毒表达载体，筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系方法 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增获取目的基因LMP2A，定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro，形成重组质粒pMSCVpuro2A，脂质体法将pMSCVpuro2A转染逆转录病毒包装细胞PT67嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆，收获病毒进行滴度测定，RTPCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达结果 限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体；筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆；收获病毒的滴度为3.2×107 CFU/L，且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录结论 携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro2A构建成功，转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒，进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67LMP2A 【关键词】 疱疹病毒4型 人 逆转录病毒 潜伏膜蛋白2A PT67细胞系 ［ABSTRACT］ObjectiveTo establish a retroviral vector encoding EpsteinBarr virus (EBV) latent membrane protein 2A(LMP2A) and a stable virus producing cell line.MethodsThe target gene LMP2A amplified by RTPCR was subcloned into retroviral vector pMSCVpuro. The recombinant plasmid pMSCVpuro2A was transfected into packaging cell PT67 by lipofectamine 2000. The transfectants were selected by puromycin and viral titer tested. The expression of LMP2A in PT67 cell line was identified by RTPCR. ResultsThe recombinant retroviral vector pMSCVpuro2A was identified by polymerase chain reaction (PCR), restrictive analysis, and DNA sequencing. A stable virus producing cell line was selected and the viral titer was 3.2×107 CFU／L. The expected 1 500 bp fragment was amplified from PT67LMP2A cells，this result indicated that LMP2A could effectively express in packaging cell PT67. ConclusionThe recombinant retroviral vector pMSCVpuro2A was constructed successfully. A stable viral producing cell line PT67LMP2A was selected and established. This study established a foundation for further study of LMP2A. ［KEY WORDS］herpesvirus 4, human; retrovirus; latent membrane protein 2A; PT67 cell line EB病毒(EBV)属人类γ亚科疱疹病毒，是传染性单核细胞增多症(IM)的病原体，与鼻咽癌(NPC)、Burkitts淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多种肿瘤的发生有关。

潜伏膜蛋白基因2A (LMP2A)是EBV潜伏期膜蛋白的一种,在体内外EBV潜伏感染的所有B细胞中均能检测出LMP2A，并且是NPC、BL等肿瘤细胞能稳定表达的少数EBV保守抗原之一，提示LMP2A参与EBV在淋巴细胞中的长期潜伏，并且可能在恶性肿瘤的发生发展中起一定作用由于LMP2A分子具有潜在的T细胞激活表位，能介导杀伤性T细胞发挥作用，因此越来越多的研究表明，LMP2A是治疗EBV相关肿瘤理想的靶抗原但LMP2A的生物学功能尚不清楚，为深入研究LMP2A的生物学活性，本研究通过逆转录病毒载体介导LMP2A基因的转移，旨在建立能稳定产生携带LMP2A基因的逆转录病毒的产毒细胞系PT67LMP2A 1 材料和方法 1.1 主要材料和试剂 BglⅡ、EcoRⅠ及T4 DNA 连接酶购自TaKaRa公司；脂质体转染试剂lipofectamine 2000和嘌呤霉素(puromycin)购自美国Invitrogene公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品；胎牛血清 购自杭州四季青公司；携带嘌呤霉素抗性基因(puro)的pMSCVpuro质粒系中国海洋大学于文功教授惠赠；工程菌Ecoli.JM109为本实验室保存菌种。

1.2 细胞 逆转录病毒包装细胞PT67购自中国武汉典型培养物保藏中心，用含体积分数0.10的胎牛血清、100 kU/L的青霉素、100 g/L链霉素的DMEM，于37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中培养 1.3 逆转录病毒的制备 1.3.1 引物设计和目的基因的制备 根据GenBank提供的LMP2A基因编码序列，DNAstar软件设计扩增EBV LMP2A读码框架的特异性引物，并在上游引物和下游引物的5′端分别引入BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点和保护碱基其上游引物序列为：5′GGCAGATCTATGGGGTCCCTAGAAATGGTG3′,下游引物序列为： 5′CGGAATTCTTATACAGTGTTGCGATATGG3′，扩增产物的长度为1 500 bp用TRIzol法提取EBV阳性LCL细胞总RNA，按照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cDNA用作PCR模板,扩增产物于12 g/L琼脂糖凝胶中电泳，紫外线透射仪下观察结果 1.3.2 逆转录病毒表达载体pMSCVpuro2A的构建 用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切LMP2A的PCR产物和质粒pMSCVpuro，纯化后连接形成重组质粒pMSCVpuro2A，导入工程菌Ecoli.JM109中扩增，提取重组质粒。

通过PCR、限制性酶切和测序分析进行鉴定同时，以不含目的基因LMP2A的质粒pMSCVpuro作为载体对照 1.3.3 重组逆转录病毒的包装及阳性克隆的筛选 常规培养包装细胞PT67达70％～80％汇合时，采用脂质体法转染重组质粒pMSCVpuro2A，具体操作参照lipofectamine 2000说明进行转染48 h后以1∶10传代，待细胞贴壁后加嘌呤霉素至终质量浓度10 mg/L进行筛选约10 d后可见阳性克隆出现，分别选取细胞克隆扩大培养，获得产毒细胞系PT67LMP2A收集细胞培养上清，用0.45 nm的滤器过滤后，置-70 ℃冰箱保存备用，所获病毒命名为vMSCV2A,载体对照命名为vMSCV,采用NIH3T3细胞测定重组逆转录病毒的滴度 1.3.4 病毒滴度的测定 制备含量为5×109/L的NIH3T3单细胞悬液，感染前1 d接种于6孔细胞培养板24 h后细胞达40%～50%时吸去原培养基，加入不同稀释度的含体积分数0.05血清的病毒上清（从10-1开始倍比稀释至10-6）每孔加polybrene(8 mg/L)作用3 h以降低膜表面电荷，促进逆转录病毒感染细胞，然后补加培养基3 mL至polybrene的终质量浓度为2 mg/L。

继续培养48 h，使用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化单层细胞，以1∶5传代至6孔板24 h后加入含puromycin(10 mg/L)的选择性培养基，每2～3 d换液1次5～6 d后，降低嘌呤霉素浓度（5 mg/L）继续维持培养，直到阳性克隆形成（约为2～3周），显微镜下进行计数公式为：病毒滴度（CFU/mL）=平均抗性细胞克隆×稀释倍数×1 000 1.3.5 RTPCR检测LMP2A的表达 分别提取转染重组质粒pMSCVpuro2A和载体对照质粒的PT67抗性细胞克隆总RNA，用DNase消化处理排除DNA的干扰，RTPCR扩增目的基因LMP2A同时以DNase消化处理的RNA为模板进行PCR检测，证实RNA中确实无DNA污染,以EBV阳性的LCL作为阳性对照，PCR产物于12 g/L琼脂糖凝胶中电泳观察结果 2 结 果 2.1 重组质粒pMSCVpuro2A的鉴定 EcoRⅠ和BglⅡ双酶切产物电泳可观察到约6.3 kb和1 500 bp的DNA条带；PCR扩增出大小约1 500 bp的条带，与预期结果相符，结果见图1正反双向测序结果显示重组质粒目的基因插入方向正确，核酸序列准确无误，读码框架完整。

图1 重组质粒pMSCVpuro2A的鉴定 ①:Marker DL15000;②:BglⅡ和EcoRⅠ双酶切重组质粒pMSCVpuro2A;③:BglⅡ单酶切重组质粒pMSCVpuro2A;④:阳性对照(EBV阳性LCL);⑤:pMSCVpuro2A的PCR扩增产物;⑥:pMSCVpuro PCR扩增产物 2.2 阳性克隆的筛选 重组质粒转染PT67细胞后，加嘌呤霉素筛选抗性细胞克隆，每2 d换液1次，筛选至第5天出现大量细胞死亡，第8天时可观察到由数个细胞组成的阳性克隆，未转染重组质粒的对照细胞则几乎全部死亡当细胞长至70％～80％汇合时，换半量不含嘌呤霉素的完全培养基，每24 h收取培养液上清为病毒原液 2.3 逆转录病毒滴度测定 收集含有逆转录病毒的上清液感染NIH3T3细胞测定病毒滴度，得到逆转录病毒vMSCV2A的病毒滴度为3.2×107 CFU／L 2.4 重组逆转录病毒的RTPCR鉴定 提取PT67LMP2A总RNA,RTPCR产物琼脂糖电泳显示特异性1 500 bp预计大小的片段，表明重组腺病毒在293细胞能有效转录(图2) 3 讨 论 EBV对宿主细胞的感染可分为潜伏感染和裂解感染两种类型，EBV相关肿瘤组织中病毒主要以潜伏感染的形式存在[1]。

由于在EBV相关肿瘤组织中，EBV只感染癌细胞而不感染正常细胞，使得靶向基因治疗有可能通过EBV而实现采用免疫学方法治疗EBV相关肿瘤是近年来倍受关注的焦点应用EBV某种基因表达载体转染抗原提呈细胞(APC)如树突状细胞(DC)等，可以诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)杀伤EBV阳性肿瘤细胞起到抗肿瘤作用，目前此类研究仅局限于体外实验[2，3]鉴于EBV在肿瘤组织中多以潜伏感染的形式存在，故EBV核抗原（EBNAs）和潜伏膜蛋白（LMP1和LMP2）基因是可以被采用的靶基因在EBNA1分子中含有丰富的甘氨酸丙氨酸重复序列，可以影响HLAⅠ类分子对其的处理和递呈；LMP1是重要的转化基因，其编码蛋白和EBV细胞转化功能密切相关，因此两者都不适于作为EBV相关肿瘤免疫治疗研究中治疗性疫苗的靶抗原而其他EBNAs和LMP2均含有能被具有MHC限制性的病毒特异性CTL识别的抗原表位，能介导细胞毒性T细胞发挥作用，是较为理想的靶抗原[4，5]LMP2A本身不是转化基因，但在EBV潜伏感染及转化细胞过程中发挥重要作用。