植物内生菌DNA提取方法(共3页).docx

精选优质文档-----倾情为你奉上在提取植物内生菌之前，植物需要表面灭菌，其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1 min，再将植物浸泡在70%酒精中1 min，然后用硫代硫酸盐/Ringer’s（林格氏液）清洗3次，每.次1 min根和茎（土表面以上1 cm处）都要灭菌处理，将根茎切成片状为了更好地分析细菌的位置，灭菌后茎表皮撕下，茎内部按照之前的方法灭菌表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取DNA植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织，步骤为溶解、提取和纯化步骤（方案一），或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞（方案二）东南景天表面灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30 min，用蒸馏水洗3次，每次3 min用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与植物地上部分开将根系用70 %酒精浸泡2 min，无菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次1 min，然后用无菌水冲洗3次，每次2 min，最后一次清洗液涂LB平板1. 将2 g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5 mL磷酸钠缓冲液（19.9 g Na2HPO4H2O，1.27 g NaH2PO42H2O，H2O 定容到1 L）研磨至匀浆。

2. 将植物匀浆转移至50 mL无菌离心管中，摇床200 rpm振荡1-2 h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来3. 取4 mL悬液于新的无菌离心管中，12 000g离心10 min收集菌体细胞4. 弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL 1TE buffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10 mg mL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h5. 加入50μL 20% SDS和8μL 20 mg mL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h，期间轻轻上下颠倒混匀数次6. 加入200μL 5 M NaCl，涡旋振荡15 s，12000g离心10 min7．取上清液，并向上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），彻底混匀，12000g离心10 min8. 上清液转移至新的无菌离心管中，重复步骤7一次9. 上清液转移至新的无菌离心管中，加入0.6倍体积（0.6 vol）的冰冷的异丙醇，4℃放置1 h10. 4℃，12000g离心10 min，弃上清11. 沉淀用70 %冰乙醇清洗，离心，弃上清12. DNA沉淀室温风干后，用无菌超纯水溶解13. DNA纯化采用TIANquick Midi Purification Kit。

微生物16S rRNA基因 V5-V6-V7区域扩增引物：799F2：GATGG CCATT ACGGC CNNNN NN1193R：ACGCA TCCCC ACCTT CCTC用含10 % SDS提取缓冲液(NaP缓冲液)重新悬浮细胞团块用直径0.11mm的玻璃珠珠打操作50 s，以溶解细胞用苯酚-Tris (pH 8)溶液和氯仿/异戊醇提取，用0.6 vol的异丙醇和0.5 mol/L NaCl通过沉淀再次获得DNA用70 %的乙醇洗涤细胞团块，真空干燥，再溶解在50μl的超纯水中原始DNA提取物用Glassmilk purification kit (Bio101, La Jolla, CA)进一步纯化所需试剂：Na2HPO4H2O，NaH2PO42H2O，10 % SDS（十二烷基硫酸钠），Tris饱和酚，氯仿/异戊醇（体积比24:1混合），异丙醇，0.5 mol/L NaCl，70 %乙醇苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。

经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用 为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定Tris平衡苯酚的配制方法 1. 使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，无需重便可用于分子生物学实验。

但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其进行重除去诸如醌等氧化产物，这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等因此，苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要，我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验 2. 操作注意：苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等所有操作均应在通风橱中进行，与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇 3. 苯酚平衡：因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相，因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上，苯酚平衡操作方法如下： ① 液化苯酚应贮存于-20℃，此时的苯酚呈现结晶状态从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温，然后在68℃中使苯酚充分溶解 ② 加入羟基喹啉（8-Quinolinol）至终浓度0.1％该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂，同时因其呈黄色有助于方便识别有机相 ③ 加入等体积的1M-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相 ④ 重复操作步骤③。

⑤ 加入等体积的0.1M-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相 ⑥ 重复操作步骤⑤，稍微残留部分上层水相 ⑦ 使用pH确认有机相的pH值大于7.8 ⑧ 将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存唐琳的引物：F357GC(5’-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG CCTAC GGGAG GCAGC AG-3’)R518(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)专心---专注---专业。