实验十一dna的定量测定.doc

实验实验十一十一 DNA 的定量的定量测测定定-二苯胺法二苯胺法一．目的一．目的学习和掌握二苯胺法测定 DNA 含量的原理和方法二、原理二、原理DNA 分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成-羟基-a-酮基戊糖，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，在一定波长范围内，化合物蓝色的深浅与 DNA 的含量成比例关系，可用比色法测定三、三、实验仪实验仪器器试管移液管7220 分光光度计四、四、实验试剂实验试剂1、DNA 标准液（200ug/ml）：称取 10mgDNA 钠盐溶于 5mol/l 氢氧化钠溶液并稀释至 100ml2、二苯胺试剂：A 液：称取纯二苯胺 1.50g，溶于 100ml 冰乙酸，再加浓硫酸 1.5ml贮于棕色瓶中B 液：称取 1.6ml 乙醛溶于 100ml 蒸馏水中，临用时配制临用时，将 20mlA 液和 0.1mlB 液混合即可五、五、实验实验步步骤骤1.标准曲线的绘制取干燥的试管 6 支，编号，按下表加入试剂：4.04.04.04.04.04.0二苯胺试剂00.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.61.20.80.40DNA标准液5432104.04.04.04.04.04.0二苯胺试剂00.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.61.20.80.40DNA标准液5432102.样品测定吸取 DNA 样液 2ml，加入二苯胺溶液 4.0ml, 加毕，混匀，在 60 度水浴中保温 45 分钟，冷却后，在 595nm 波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得 DNA 的质量。

六．六．实验结实验结果果y = 0.1084x + 0.0014 R2 = 0.974700.10.20.30.40.50.60123456 DNA浓度为（40*组数）/3 ug/ml分光光度值系列1 系列2 系列3 线性 (系列3) 线性 (系列3)解得 DNA 样液浓度为 112.52ug/ml七．七．实验实验分析分析因为二苯胺稍溶于水，溶于乙醇、乙醚、苯等，能溶于浓无机酸中，但用水稀释时又析出故在实验后，如果继续往试管里加蒸馏水则会产生白色混浊，并且当蒸馏水加到一定量时，白色混浊又会消失测测定定 DNA 浓浓度的方法有两种度的方法有两种,即利用分光光度计法测定 DNA 的紫外光吸收值;另一种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量.紫外光吸收法:因为组成核酸的碱基(G,A,T,C)在 260nm 处具有强吸收峰,所以通过测定 260nm 的吸收峰即可对 DNA 进行定量.但有时也会因为所处溶液的 pH 值不同而导致吸光系数的不同.因此,一般在中性 pH 值左右的环境中进行测定.这种方法常用于测定比较纯的样品.溴化乙锭荧光强度法:当 DNA 含量很低以及样品中杂质含量高时,会影响紫外光吸收值的测定,这时,可以采用测定嵌入 DNA 中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度,因为这种荧光的强度与DNA 总质量数成正比.注意事项1、二苯胺法测定 DNA 含量灵敏度不高，待测样品中 DNA 含量低于 50mg/L 即难以测定。

乙醛可增加二苯胺法测定 DNA 的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度2、样品中含有少量 RNA 并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰 DNA 定理。