（新编）碱变性法提取质粒.doc

质粒DNA 小量提取试剂盒一、产品简介采用SDS 碱裂解法，结合硅胶膜 选择性吸附DNA 的方法，适合1-4ml 细菌培养物中提取多至20 μg 质 粒DNA纯化的质粒DNA 适合用于酶切、 PCR、测序、转化和转染等分子生物学实验二、试剂盒组成和储存组成内容DBI-2011 (50次) DBI-2012 (200次)RNase A1＊ 30 μl 120 μlBuffer BL 15 ml 60 mlBuffer P1 15 ml 60 mlBuffer P2 15 ml 60 mlBuffer P3 20 ml 90 mlBuffer WA§ 19 ml 75 mlBuffer WB§ 16 ml 65 mlDNA 吸附柱-B 50 套200 套1.5 ml 离心管50 个200 个TE※ 15 ml 30 ml说明书 1 份 1 份＊RNase A1: 50 mg/ml, -20℃ 长期保存；第一次使用前将RNase A1全部加入Buffer P1中，于4℃保存§Buffer WA和Buffer WB，使用前按 试剂瓶所示体积加入无水乙醇或者 95%乙醇，混合均匀※TE：10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0(25°C)。

除RNase A1和Buffer P1(已加入RNase A1)外，其他 组成成分于室温 储存三、注意事项1. Buffer P3 和Buffer WA 含刺激性化合物，避免沾染皮肤、眼睛和衣服、谨防吸入口鼻若沾染皮肤、眼睛，立即使用大量水或生理盐水冲洗沾染处，必要 时寻求医疗 咨询2. 使用后应及时盖紧试剂瓶盖子，以免影响下次使用效果3. 操作步骤A2 和B2，充分悬 浮细菌，无可 见的块状菌团，不然会影响裂解效果4. 操作步骤A3 和B3，缓慢翻 转离心管，以免机械力打断基因组DNA 而导致最后纯化的质粒DNA 中有基因组DNA 污染，同时避免打断质粒 DNA，保持其完整性5. 操作步骤A3 和B3，溶液呈透亮后，需立即加入Buffer P3，避免质粒DNA 长时间暴露于Buffer P 2（含NaOH，强碱性环境）中完全变性为单链DNA 后无法复性恢复为超螺旋状态6. 操作步骤A4 和B4，形成紧实 的大团状凝集物前需缓慢 摇晃离心管，避免机械力打断基因组DNA 和质粒DNA；之后快速剧烈摇晃3 次将凝集物打散，有助于充分释放质 粒DNA，从而提高 产量7. 操作步骤5，室温放置1-2 min，有助于提高 DNA 吸附效率，从而提高产量。

8. 操作步骤 10，室温放置 1-2 min，有助于提高 DNA 洗脱效率，从而提高产量四、操作步骤平衡DNA 吸附柱(此步骤可提高硅胶介质吸附DNA 效率，可在使用本试剂盒当天任何时间操作)在DNA 吸附柱-B（置于2 ml 离心管中）中加250 μl Buffer BL，室温12,000×g 离心1 min，弃废液，将DNA吸附柱-B 放回2 ml 离心管中根据菌量选择方法A 或者B 提取质粒DNA从≤2× 109 细菌中提取质粒DNA，请选择方法A. 从少量细菌中提取 质粒DNA从2×109-4×109 细菌中提取质粒DNA，请选择方法B. 从常 规数量细菌中提取质粒DNA；▲ 培养至OD600 为1-1.5，此 时1 ml 菌液中约含1.0×109 细胞从 1-2 ml 菌液中提取质粒DNA 按照方法A 操作，从2-4ml菌液中提取质粒DNA 按照方法B 操作▲ 如果细菌生长状态不佳，视 离心收集后细菌沉淀体积选择提取质粒DNA 的方法估算 细菌沉淀体积，细菌沉淀体积≤30 μ l按照方法A 操作，细菌沉淀体 积≥ 30 μl 按照方法B 操作▲ 方法A 可以减弱Buffer P2（含NaOH，强碱性环境）对质粒DNA 的变性作用，减少 质粒DNA 完全变性为单链DNA 后无法复性恢复为超螺旋状态的比例。

A. 从少量细菌中提取质粒DNA实验准备：第一次使用前，将试剂 盒携带的RNase A1 全部加入 Buffer P1 中检查Buffer P2 是否析出白色沉淀，如有沉淀在37℃放置数分 钟，沉淀溶解后恢复至室温使用A1. 用干净的1.5 ml 离心管，室温 12,000×g 离心1 min 收集≤2×109 细菌；弃尽上清A2. 加入 100 μl Buffer P1（含 RNase A1）， Vortex 震荡或者用 Tips 充分悬浮细菌A3. 加入100 μl Buffer P2，缓慢翻转离心管混合均匀，直至溶液呈浅黄色透亮状A4. 立即加入140 μl Buffer P3，缓慢翻转离心管混合均匀，形成紧实的大团状凝集物后（约摇晃15 次），快速剧烈摇晃3 次使凝集物呈松散状；室温12,000×g 离心5 min▲ 如果离心上清中有漂浮的凝集块，快速 摇晃3 次后再次离心继续操作步骤5.B. 从常规数量 细菌中提取质 粒DNA实验准备：第一次使用前，将试剂 盒携带的RNase A1 全部加入 Buffer P1 中检查Buffer P2 是否析出白色沉淀，如有沉淀在37℃放置数分 钟，沉淀溶解后恢复至室温使用。

B1. 用干净的1.5 ml 离心管，室温 12,000×g 离心1 min 收集2×109-4× 109 细菌；弃尽上清B2. 加入250 μl Buffer P1（含RNase A1）， Vortex 震荡或者用Tips 充分悬浮细菌B3. 加入250 μl Buffer P2，缓慢翻转离心管混合均匀，直至溶液呈浅黄色透亮状B4. 立即加入350 μl Buffer P3，缓慢翻转离心管混合均匀，形成紧实的大团状凝集物后（约摇晃15 次），快速剧烈摇晃3 次使凝集物呈松散状；室温12,000×g 离心5 min▲如果离心上清中有漂浮的凝集块，快速 摇晃3 次后再次离心继续操作步骤5.DNA 结合5. 将步骤 4 中溶液倒入或者用移液器转入 DNA 吸附柱-B 中（勿转入管底沉淀），室温放置1-2 min6. 室温8,000×g 离心1 min，弃 废液，将 DNA 吸附柱-B 放回 2 ml 离心管中洗涤实验准备：第一次使用前，按试剂 瓶所示体积在Buffer WA 和Buffer WB 中加入无水乙醇或者95%乙醇7. 在DNA 吸附柱-B 中加入500 μl Buffer WA，室温 8,000×g 离心1 min，弃 废液，将DNA 吸附柱-B 放回2 ml 离心管中。

8. 在DNA 吸附柱-B 中加入500 μl Buffer WB，室温 8,000×g 离心1 min，弃 废液，将DNA 吸附柱-B 放回2 ml 离心管中重复此步骤9. 室温12,000×g 离心2 min洗脱实验准备（可选）：65℃预热TE 或者去离子水10. 将DNA 吸附柱-B 转入试剂盒携带的1.5 ml 离心管中，向DNA 吸附膜的中央加50-200 μl TE 或者去离子水，室温放置1-2min，室温12,000 ×g 离心1 min▲65℃预热TE 或者去离子水，可以提高洗脱效率▲离心结束后将 1.5 ml 离心管中的洗脱液加到吸附膜的中央，重复此步骤，可以提高洗脱效率。