聚合酶链式反应.doc.docx

聚合酶链式反应聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍反应准备聚合酶链式反应PCR反应体系10×扩增缓冲液10μlP-F0.5ul4种dNTP混合物（终浓度）各100～250μmol/LP-R0.5ul引物（终浓度）各5～20μmol/L Go Taq 酶5ul模板DNA0.1～2μg 模板DNA0.5ulTaq DNA聚合酶5～10 U H2O3.5ulMg2+（终浓度）1～3mmol/L补加双蒸水100 μl其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整。

PCR反应五要素：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌其中Taq扩增效率高但易发生错配Pfu扩增效率弱但有纠错功能模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构聚合酶链式反应PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补引物设计的基本原则①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照③引物内部不应出现互补序列④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C⑦引物的5 ′端可以修饰如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等法医学标本有血斑、精斑、毛发等标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板聚合酶链式反应反应的控制①PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子关于PCR反应条件控制②镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）⑤引物 浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L⑥反应温度和循环次数变性温度和时间 95℃，30s退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）Tm值=4(G+C) +2(A+T)循环次数 ：一般为25 ～ 30次。

循环数决定PCR扩增的产量模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量但循环数并不是可以无限增加的一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”PCR reaction volumeName of gRNAR3M3(200ng/ul)R2M2(200ng/ul)Positive control(12)Genome DNA(1-5ul) (50-100ng)0.60.60.6Primer F (10uM)0.70.70.7Primer R (10uM)0.70.70.7Go Taq555Nucleases-free water to 15ul3331. PCR条件94℃ 2minutes initial denaturation94℃ 30s denaturation57℃ 20s 34 Cycle annealing72℃ 1minute extension72℃ 5minutes final extension14℃ forever refrigeration聚合酶链式反应循环参数聚合酶链式反应预变性模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

聚合酶链式反应变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间.变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败聚合酶链式反应引物退火退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度然后在此次实验基础上做出预估退火温度对PCR的特异性有较大影响聚合酶链式反应引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp聚合酶链式反应循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增聚合酶链式反应最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链聚合酶链式反应步骤标准的PCR过程分为三步：聚合酶链式反应DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA聚合酶链式反应退火（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链聚合酶链式反应延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳梯度PCR仪）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度聚合酶链式反应检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判但因为其简捷易行，成为了主流检测方法.聚合酶链式反应反应特点聚合酶链式反应特异性强聚合酶链式反应PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性其中引物与模板的正确结合是关键引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高聚合酶链式反应灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。

能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌聚合酶链式反应简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应扩增产物一般用电泳分析.聚合酶链式反应纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测常见问题PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失聚合酶链式反应假阴性不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及溴乙锭的使用， ④PCR循环条件模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑。