针刺对快速老化模型鼠脑中衰老相关基因表达的调整作用-衰老-光老化.docx

针刺对快速老化模型鼠脑中衰老相关基因表达的调整作用|衰老 光老化针刺对快速老化模型鼠脑中衰老相关基因表达的调整作用|衰老 光老化 [摘 要]目的： 探讨针刺调整作用在分子水平的反映方法：以快速老化模型鼠(SAM)脑中衰老相关基因的表达为研究对象，应用由磁珠分离法纯化mRNA，SMA RT-PCR cDNA合成和AFLP-银染法结合形成的m RNA-AFLP分析技术，进行mRNA指纹检测，寻找衰老相关性差异表达的基因片段，并观察针刺对其表达水平的影响结果：随机应用20对引物作选择性AFLP扩增，共发现42条带型较为清晰的SAMP、R两系组间差异表达带，其中，33条(约占78.6%)在P系相对于R系低表达，9条(约占21.4%)在P系相对于R系高表达针刺SAMP10的不同腧穴，可使异常低表达的基因表达水平不同程度地上调，使异常高表达的基因表达水平不同程度地下调，其变化均趋同于正常老化的SAMR1结论：针刺对衰老机体紊乱的分子网络能发挥整体调节作用，促使其恢复协调平衡，从而延缓衰老进程 [主题词]衰老/针灸效应；基因表达；衰老/遗传学；基因表达调控 Regulatory action of acupuncture on expression of aging-corr elative genes in the brain of the senescence accelerated mouse Lu Mingxia, Yu Jianchun, Yu Tao, et al. (The First Affiliated Hospital of Tianjin TCM College, Tianjin xxxx, China) xxxxT Objective To explore regulatory action of acupuncture at molecul ar level through the study on expression of aging-correlative genes in the sene s cence accelerated mouse (SAM). Methods mRNA was purified with m agnetic bead separation method, mRNA-AFLP analysis technique formed by combinat ion of SMA RT-PCR cDNA synthesis and AFLP-silver staining method were used for fingerprinting detection, to search for gene segments of aging-correlative diff e rential expression and investigate effect of acupuncture on the expression level. Results 20 pairs of primer were randomly applied as selective AFLP amplification, 42 clear differential expression bands bet ween SAM P and R serieses were found, among them, 33 bands (about 78.6%) in Pseries were lower expression related to R series, and 9 (about 21.4%) in the P s eries were higher expression related to the R series. Acupuncture at different acupoints in the SAM P10 could up-regulate the gene expression level of the abno rmally low expression genes and down-regulate the gene expression level of the abnormally high expression genes in varying degrees. All the changes tended to the normal aging SAMR1. Conclusion Acupuncture can regulate the disor dering molecular networks in aging organisms at whole, promoting recovery of b alance, hence postponement of aging process. KEY WORDS Aging/acup eff; Gene Expression; Aging/genet; Gene Expression Regulation 针刺作用的实质在于调整作用。

由于机体机能状态或疾病性质的不同，这种调整作用在治疗效应上可以不同形式出现，但总的趋势是调整人体阴阳平衡，纠正其偏盛偏衰的病理现象，使亢者平，弱者强，恢复正常的机能状态以往对针刺调整作用的研究多从宏观角度入手，或者探讨针刺对于神经-内分泌-免疫网络的整体调整，或者探讨针刺对于某一器官某一功能的局部调整，如：胃肠的蠕动、肺的通气、肾的泌尿等功能近年，随着生命科学的发展和基因时代的到来，深入到分子水平，从微观角度探讨针刺的调整作用已日益受到广泛关注本研究以快速老化模型鼠(SAM)[1，2]为实验材料，应用mRNA-AFLP技术，试就针刺对于衰老机体脑组织中衰老相关基因表达的调整作用作一探讨 1 材料和方法 1.1 材料 以在本院成功繁殖的快速老化模型小鼠SAM系列中的脑皮质萎缩鼠SAM P10和正常老化对照鼠 SAM R1为实验动物，并主要应用以下试剂：Promega公司生产的RNA提取试剂盒(RNAgentsRTotal RNA Isolation System), mRNA 纯化试剂盒(PolyATtractR mRNA Isolation Systems), xxxxH 公司生产的cDNA合成试剂盒(xxxxPCR cDNA Synthesis Kit), GIBCO BRL 公司生产的扩增片段长度多态性分析(AFLP)试剂盒(xxxxnalysis System Ⅱ,AFLP Small Genome Primer Kit)和逆转录酶(xxxxRIPT Ⅱ RNase H-Reverse Transcriptase)。

1.2 方法 (1)动物的选择与分组 选取SAM P10和SAMR1两品系7月龄雄性小白鼠共70只，随机分为以下7组，每组各10只：P10“水沟”穴组，P10“内关”穴组，P10“太冲”穴组，P10“肾俞”穴组，P10“后三里”(相 当于足三里)穴组，P10空白对照组及R1空白对照组 (2)处理因素与方法 5个穴位组分别在相应的穴位上实施针刺，2个对照组除施加与穴位组相同力度和时间的捉抓外，不予其它任何刺激穴位定位根据中国针灸学会实验针灸研究会制订的《动物针灸穴位图谱》针刺方法：“水沟”穴用雀啄手法强刺激10次，“内关”“太冲”穴分别用捻 转泻法20秒，“肾俞”“后三里”穴分别用捻转补法20秒各组每日做相应处理1次，第7日休息，连续2周后行颈椎脱臼法处死，迅速剥取全脑 (3)全脑总RNA的制备 按照RNAgents�Total RNA Isolation System 操作指南，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿法抽提7组小鼠的全脑总RNA用1%甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA的完整性，用紫外分光光度计鉴定RNA的纯度并定量 (4)mRNA 的纯化 按照Ploy ATtract mRNA Isolation Systems操作指南，采用磁珠分离法从总RNA中分离纯化mRNA。

用1%甲醛变性凝胶电泳鉴定mRNA 的完整性，用紫外分光光度计鉴定mRNA 的纯度并定量 (5)SMART逆转录与扩增 按照xxxxPCR cDNA Synthesis Kit 操作指南，采用5’末端模板转换机制进行逆 转录和高保真长片段PCR取400ng mRNA,在10μl反应体系中进行反转录[1μol/L 3’端oligo(dT)引物(CDS primer)，1μol/L 5’端专利合成引物(SMART Ⅱ ligonucleotid e),2 mmol/L DTT,1PCR缓冲液，1 mmol/L dNTP,200 u MMLV逆转录酶]42 ℃反应1 h后加入450μl TE缓冲液进行稀释，再72 ℃加热7 min以终止反应取2μl反转录产物稀释液，在100μl体系中进行扩增(0.2 �ol/L PCR引物,0.2 mmol/L dNTP,1PCR缓冲液，2�DNA聚合酶混合物)PCR参数为先95 ℃变性1 min；后95 ℃变性15 s，65 ℃退火30 s，68 ℃延伸6 min，共16个循环反应结束后，用紫外分光光度计对cDNA扩增产物定量 (6)mRNA-AFLP分析 参照xxxxnalysis System Ⅱ操作指南，对mRNA反转录扩增所得cDNA进行AFLP分析。

首先，将cDNA在37 ℃条件下酶切消化2 h[模板cDNA 250 ng,限制性内切酶混合物EcoRI /MseI 2μl(其中酶浓度均为1.25 u/�)，1μl）反应缓冲液，总反应体系为25μ]然后，加T4 DNA连接酶混合物1μ(其中酶浓度1μ/μl)和酶切接头连接液24μl，在20 ℃2 ℃反应2 h用TE缓冲液稀释10倍后取出5μl，在51μl体系中作AFLP预扩增(预扩增引物混合物40μl，1PCR缓冲液，1u Taq DNA聚合酶)PCR参数为94 ℃变性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共20个循环将反应产物用TE缓冲液稀释10倍后取出5μl，在20μl体系中作选择性AFLP扩增(50 ng/� EcoRI引物，1.5 ng/� MseⅠ引物，1P CR缓冲液，0.5 u Taq DNA聚合酶)反应程序如下：第1循环变性、退火和延伸条件分别是94 ℃30 s，65 ℃30 s, 72 ℃60 s；在接下来进行的12个循环中，变性和延伸条件不变，退火温度每循环依次降低0.7 ℃，时间仍为30 s如此，当进行至第13循环时，退火温度即降至56.6 ℃然后，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共再进行20个循环。

扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后银染 2 结果 随机选用AFLP试剂盒提供的20对引物作选择性AFLP扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显示，观察到大量组间差异表达带，在此仅对带型较清晰者作进一步分析据统计，本实验共展示了42条带型较清晰的P、R两系组间差异表达带，其中，33条(约占78.6%)在P系。