第十章--细胞培养课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章 细胞培养,第一节 单细胞的分离,第二节 细胞悬浮培养,第三节 单细胞培养,第一节 单细胞的分离,一、单细胞的分离方法,机械法和酶切法,机械法分离叶肉细胞是先把叶片轻轻研碎，然后通过过滤和离心净化细胞优点：细胞不会受到酶的伤害；,不需质壁分离,有利于进行生理和系列化研究酶解法分离细胞,利用果胶酶、纤维素酶处理，分离出具有代谢活性的细胞，该法不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁要求：,松散性好，增殖快，再生能力强其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎适于悬浮培养 适于再生植株,第二节 细胞悬浮培养,细胞悬浮培养是将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养特点：,（1）细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；,（2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件一、培养类型,植物细胞悬浮培养即植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养.,可分为:分批培养,连续培养,分批培养,是指细胞在一定容积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培养物。

在培养过程中，除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的在分批培养中，细胞数目增长的变化情况表现为S形曲线2.成批培养的方法,(1)旋转培养,(2)往返震荡培养,(3)旋转震荡培养,(4)搅动培养,连续培养,是利用特别的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式连续培养过程中，不断注入新鲜培养基排掉等体积的用过的培养基，培养液中的营养物质得到不断补充2.连续培养的种类,(1)半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液,(2)连续培养：封闭式和开放式,二、悬浮培养,1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一 般在 3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系2、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加1倍成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：,诱导悬浮细胞系,诱导出疏松易碎的愈伤组织对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果一般颗粒细小、疏松易碎、外观湿润、鲜艳的白色或淡黄色的愈伤组织，比较疏松易碎，经过几次筛选、继代至稳定后，可以用于诱导悬浮细胞系。

悬浮培养用的培养基,可以参考愈伤组织培养基一般说来N6、MS、B5适合单子叶植物，,而MS、B5、LS、SL等适合双子叶植物悬浮细胞培养基中须附加水解酪蛋白、椰乳、脯氨酸等，并注意及时更换新鲜培养基，一般以间隔35天为宜培养基用于过滤灭菌更适合悬浮细胞的生长大规模植物细胞、组织和器官培养生产次生代谢物质；,三、细胞悬浮培养的应用,（一）植物有用物质的生产,在植物组织培养研究中，发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物2.发酵罐培养方法,（1）选择培养基,（2）细胞株建立,愈伤组织的诱导和培养,单细胞分离,细胞无性系分离,细胞株的筛选,（3）扩大培养,（4）大罐发酵培养,（5）固定细胞培养法,（二）诱发和筛选突变体,在细胞培养过程中会产生一些突变体，常采用不同培养基来进行选择，也就是把悬浮细胞培养于缺少某种营养物质或生长因子，或是添加某种抑制剂的培养基里，使突变细胞和正常细胞区别开来,（四）食品生产,通过对许多食用植物培养组织的细胞团生产的研究第三节 单细胞培养,一、单细胞培养技术,单细胞培养技术有三种，,看护培养技术,平板培养技术,微室培养技术和双层滤纸培养技术一）看护培养技术,把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织（也称看护愈伤组织）上培养，在愈伤组织和培养的细胞之间，有一片滤纸相隔。

看护培养特点,此法简便易行，效果好，易于成功但是不能在此法简便易行，效果好，易于成功但是不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程二）平板培养技术,将含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物过滤，除去组织块和大的细胞团，保留游离细胞和小细胞团将液体培养基加入0.6%,1%的琼脂，使其融化，冷却到35时，将培养基与上述细胞悬浮培养液等量混合，迅速注入并使之铺展在培养皿（约1mm厚）用封口膜封严培养皿，置于25黑暗中培养可定期镜检观察细胞的生长平板法培养,用平板法培养单细胞时，常以植板效率表示能长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分数，求算公式为：,一般悬浮培养液要达到最终所要求的植板细胞密度的2倍，可以通过加入液体培养基进行稀释，或通过低速离心使细胞沉降，弃去部分培养基进行浓缩三）微室培养技术,由悬浮培养物中取出1滴含单细胞的培养液，置于一张无菌载片上，在培养基的四周与之隔一定距离加上一圈石蜡油，然后在左右两侧各加一滴石蜡油并分别置一张盖片，第3张盖片架在前两个盖片之间，那1滴含有单细胞的培养液就被覆盖于微室之中，最后把筑有微室的整张载片置于培养皿中进行培养当细胞团长到一定大小时，将转移到新鲜的液体或半固体培养基上培养。

通过微室培养技术，可对细胞培养过程连续进行显微观察，了解到一个细胞的生长、分裂、分化和形成细胞团的全部过程微室培养法,即将细胞培养在很少量的培养基中在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来显微镜下直接观察细胞的生长过程微室培养法,（1）微室内不能有气泡2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖玻片 的厚度要在0.170.18毫米左右3）观察时要保持温度和培养时的一致四）双层滤纸培养,Horsch等（1980）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法二、影响单细胞培养的因子,1条件培养基,条件培养基可有利于单细胞的生长与分裂,2细胞密度,临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反一般要求每毫升在1000个细胞以上二、影响单细胞培养的因子,3生长物质,生长激素加1种细胞分裂素和几种氨基酸临界密度只需25-30细胞/毫升4pH,5CO2,。