猕猴桃细菌性溃疡病菌检疫技术操作办法.doc

猕猴桃细菌性溃疡病菌检疫技术操作办法字体：大 中 小2009-9-1来源：省林检局阅读： 160 次[关 闭]1 主题容及应检围1.1 本办法规定了猕猴桃细菌性溃疡病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae Takikawa et al. 的检疫检验及检疫处理操作办法1.2 本办法适用于林业植物检疫机构对猕猴桃属Actinidia spp.植物活体、残体的检疫检验和检疫处理2 产地检疫2.1 种苗繁育基地的建立2.1.1 培育的猕猴桃，应从无病区采集接穗，或用无病虫的当年生半木质枝条作插条2.1.2 加强晚秋水、肥管理，避免在强风和冬季低温的高海拔区，即易发生霜冻的地方建园2.2 踏查2.2.1 在种苗繁育基地、猕猴桃栽植地的果园、林场，以自然界线、道路等为单位进行线路（目测）踏查2.2.2 调查寄主的主干及分枝上部是否有淡黄色或黄褐色病斑；病斑处是否有小孔，从中向外流出白色或铁锈色液体，病部下方形成深褐色污斑。

2.2.3 调查枝条上是否有暗绿色或暗褐色水渍状纵向、线形龟裂；新梢是否呈暗褐色萎蔫枯死，病部浸出白色水渍状液体2.2.4 调查叶片上是否有红色小点，或大小为2–3 mm的褐色多角形病斑，周围有明显黄色水渍状晕圈，叶片向里或向外翻卷2.2.5 确认有疫情需进一步掌握危害情况的，需设标准地（或样方）做详细调查2.3 标准地（或样方）调查2.3.1 种苗繁育基地样方设置与调查2.3.1.1 样方的累积面积应不少于调查总面积的5%2.3.1.2 每块样方面积为0.1 hm2，采取棋盘式取样法，抽取样树5–10株，进行病害分级调查2.3.2. 果园标准地设置与调查2.3.2.1 按果园面积设置，10 hm2以下（含10 hm2）设1块，每增加5 hm2增设1块2.3.2.2 每块标准地面积为0.1 hm2，采取棋盘式取样法，抽取样树10株，进行病害分级调查 2.4 病害分级标准单株病害分级标准Ⅰ级 全株叶、蔓无病 代表值0；Ⅱ级 1–20片叶和1个侧蔓发病，或1/3以下的新梢发病 代表值1；Ⅲ级 21–30片叶和2–3个侧蔓发病，或1/3–1/2的新梢发病 代表值2；Ⅳ级 31片以上叶和1–2个主蔓发病，或1/2以上新梢发病 代表值3；Ⅴ级 主干发病1/3，或多数侧蔓发病、植株部分枯死 代表值4；Ⅵ级 主干发病1/3，或全部主蔓枯死发病、全株枯死 代表值5。

果园病害分级标准（以被害株率为标准）轻 被害株率 10%以下； 中 被害株率 11%–30%； 重 被害株率 31%以上2.5 所采集的感病材料应包含植物的所有部分和各种症状部分应尽可能采集感病初期的病株部分，以利于病原细菌的分离2.6 样品置于聚乙烯袋或其它合适容器保鲜和防止污染样品应冷藏存放，避免受到的照射3 调运检疫3.1 抽样比例 3.1.1 苗木100株以（含100株）的应全部检查；100–1000株按10 %抽取；1000株以上按一批货物总件数（株）的5 %抽取3.1.2 植株及植株残体应全部进行检查3.2 抽样方法 3.2.1 苗木按照抽样比例，采取分层方式设5个样点进行抽样3.2.2 对携带有病症的植株及植株残体应全部进行检查3.3 现场检验3.3.1 检查寄主的叶片是否向里或向外翻卷，并有红色小点或多角形病斑，周围有明显黄色水渍状晕圈3.3.2 检查1–2 a枝条上是否有水渍状纵向、线形龟裂，新梢是否萎蔫枯死，并有白色水渍状液体溢出3.3.3 检查寄主干部是否在病斑下方呈深褐色并有铁锈色液体溢出4 检疫检验4.1 溢菌检验 在具典型症状的病部上，取病健交界处的一小块病组织，在显微镜下切片检查是否有大量细菌液溢出。

4.2 分离培养检验4.2.1 取小块病斑组织，经表面消毒，灭菌水洗3次后，研碎静置10 min，采用假单孢属选择性培养基进行分离，将分离并经纯化后的细菌移植到BPA培养基斜面上培养48 h，置8 ℃冰箱保存分离鉴定方法见附录14.2.2 检查在BPA培养基平板上是否形成污白色、圆形、全缘、凸起、光滑、直径约为1–3 mm的菌落；在KBA培养基上未见荧光；在Luisetti培养基上发生蓝色荧光及在SPA培养基上呈粘液状菌落4.3 染色检验4.3.1 鞭毛染色 采用西萨—基尔染色法经染媒5–7 min→水洗干燥→苯酚品红染色5 min→水洗干燥后镜检 显微镜下菌体和鞭毛为阴性反应，呈红色，极生1–3根4.3.2 革兰氏染色 采用结晶紫草酸胺染色法经固定涂片→染色1 min→水洗数秒吸干→碘液处理1 min→水洗数秒吸干→褪色30 s→水洗数秒吸干→复染10 min→水洗吸干后镜检 显微镜下菌体为革兰氏阴性反应，呈红色4.4 生理生化检验4.4.1 生长与温度试验 菌株生长最高温度为35 ℃；最适生长温度为25–28 ℃；致死温度为55 ℃条件下10 min。

4.4.2 精氨酸双水解酶检验 配制Thornley培养基每试管装3–4 ml培养基灭菌冷却针刺接种细菌至培养基底部立即用灭菌凡士林封管→在27℃条件下培养7 d 在此条件下，精氨酸双水解酶为阴性，颜色不变4.4.3 果聚糖（Levan）试验 用细菌悬浮液，在SPA培养基上，或用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线在25℃条件下培养3–7 d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应 在此条件下，在SPA培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落4.4.4 冰核活性测定 用直径16 mm的螺口试管，装浓度大于168 CFU/ml细菌液3–5 ml，加盖置于–4℃水浴中（水浴含11.2%的食盐水）如此液在5 min结冰，表明有冰核活性 在上述条件下，菌液经测定为无冰核活性4.5 碳素化合物的利用和分解4.5.1 碳素化合物产酸试验 配制Ayers培养基在适温下放置4–5 d后，每5 ml培养液接种0.1 ml含108 CFU/ml 的菌悬浮液，适温下培养3–4周，产酸时培养液变为黄色 在此条件下，培养液变为黄色，能利用葡萄糖、棉子糖、山梨糖、蔗糖产酸。

4.5.2 V. P试验（产生3–羟基丁酮试验） 将细菌接种于甲基红试验用培养液，培养2–4 d，按每毫升加40% KOH（含0.3% 肌酸或肌酐）0.1 ml溶液，置48–50℃水浴中，充分摇动2 h，在4 h观察出现红色为阳性反应 在此条件下，培养液测验为阴性反应，不呈红色4.5.3 甲基红试验（MR试验） 将细菌接种于葡萄糖蛋白胨培养液，适温下培养2–4 d以上，取培养液5 ml，加甲基红试剂2–3滴培养液变红色为阳性反应，黄色为阴性反应 在此条件下，培养液测验为阴性反应，呈黄色4.6 氮素化合物的分解4.6.1 硝酸盐还原试验 将硝酸盐半固体培养基用4% NaoH调节pH至7.0–7.2每支试管分装5–10 ml培养基灭菌，针刺接种细菌试管培养3、5、7 d后，分别用Griess–Liosvary试剂测定法测定亚硝酸如呈红色，表示有亚硝酸根为阳性反应 在此条件下，培养液测验为阴性反应，不呈红色4.6.2 吲哚试验 4.6.2.1 配制胰蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g 、蒸馏水1000.0 ml的培养液，接菌后适温培养4.6.2.2 将滤纸剪成小条，在饱和草酸溶液中浸过后取出，灭菌烘干后，夹在棉花塞和管壁之间，使滤纸悬挂在不接触培养液的液面上，有吲哚产生的滤纸变淡红色。

在此条件下，滤纸不变淡红色，不产生吲哚4.7 大分子化合物的分解4.7.1 明胶液化 在BPA培养基中加10%–12%的明胶，每支试管4–10 ml，在121℃灭菌12–15 min，冷却后用穿刺法接菌，在适温中培养3、7、14和21 d，将试管取出置冷水和4℃冰箱中，使明胶凝固，检查明胶是否凝固或液化，并以未接菌的明胶作对照 在此条件下，该菌株不能使明胶液化4.7.2 石蕊牛乳反应 用石蕊牛乳培养液，间歇灭菌3次，每次通蒸气20–30 ml接种后于28℃条件下培养，以不接种的石蕊牛乳作对照，定期观察4–6周 在此条件下，石蕊牛乳反应变蓝，示有微碱性4.7.3 吐温80的水解 采用Sierra方法测定将吐温80高压蒸气灭菌后，取10 ml加入蛋白胨10 g、CaCI2H2O 0.1 g、琼脂17 g、蒸馏水1000 ml，pH 7.4的培养基中，混匀后制成平板，点种细菌，适温培养7 d如在菌落周围有不透明白色沉淀区出现，表示吐温80被水解，为阳性反应 在此条件下，吐温80能水解，为阳性反应4.8 其它生理生化试验4.8.1 氧化酶试验 在培养皿放一滤纸，滤纸上加3–4滴1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。

用玻棒挑取生长24 h的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10 s变成紫色，为阳性反应；在60 s以后变色或一直不变色，为阴性反应 在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应4.8.2 过氧化氢酶（接触酶）试验 挑取在固体培养基上生长24–48 h的菌苔，置于干净玻片上，滴加3%的过氧化氢，30 s有大量气泡产生为阳性，不产气泡为阴性 在此条件下，菌苔过氧化氢酶试验为阳性4.9 致病性测定4.9.1 烟草过敏性反应 将在26℃条件下，培养72 d的菌株，用无菌水配成3108 /ml的菌液，对烟草下表皮进行皮下接种，在24 ℃条件下经20–24 h后检查是否出现过敏性坏死斑4.9.2 植株致病性测定 将分离菌株接种在植株健叶或休眠枝条上，菌液浓度6108 /ml10–15 d后或次年2月下旬到3月下旬，检查是否出现典型叶斑症状，具晕圈；休眠枝条有溃疡症状及菌浓 根据上述检验结果，对照病原特征（附录2），鉴定是否为猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae Takikawa et al.5 除害处理5.1 禁止从疫情发生区调运染疫植物活体。

5.2 发现带疫植株应喷洒1万单位农用链霉素3000倍液、30%琥珀酸铜（DT）胶悬剂200倍液或70% 百菌通 500倍液分2–3次进行处理附录1猕猴桃细菌性溃疡病菌的分离鉴定方法1、病原鉴定根据叶片上的水渍状晕圈和枝干上白色水滴状菌脓初步诊断为细菌性病害取病健交界处组织一块，放于载玻片上，向小块上滴1–2滴无菌水或蒸馏水，加盖玻片后立即用低倍显微镜观察水滴与组织交界处，见到云雾状菌溢，亦可证明组织有细菌存在2、病原分离新鲜病健交界处的病组织洗净后切成4 mm4 mm小块，用灭菌水冲洗3次；分别用70％酒精和0.5％–1％的次氯酸钠进行表面消毒，病组织在消毒液中浸泡1–2 min，再用无菌水冲洗3次，按下列方法进行分离培养皿稀。