去壁低渗法制备植物染色体标本及染色体组型分析.docx

去壁低渗法制备植物染色体标本及染色体组型分析植物染色体的常规压片技术在植物细胞遗传学研究中发挥了重要作用，特别 是许多植物的染色体计数和组型分析都是用这种方法完成的，但这种方法也存在 一定缺陷，如染色体很难完全散开，容易产生重叠、变形、断裂，影响显带结果 等,给核型分析增加了不少困难另外，在当前植物染色体Giemsa分带研究中， 由于压片法很难完全除掉细胞质及细胞壁对染色体的覆盖，因而常常造成 Giemsa 带可重复性较低，使植物染色体 Giemsa 分带研究受到一定的影响其 次，由于植物染色体处理方法尚不理想，影响到亚显微结构的研究因此改革植 物染色体压片法是促进植物染色体的研究，特别是植物染色体 Giemsa 分带和亚 显微结构研究的重要关键20 世纪 70 年代以来，一些从事植物染色体研究的学 者，参照动物及人类染色体标本制备技术，开展了对植物细胞去壁、低渗、火焰 干燥方法的研究，取得了很好的结果，目前这种方法已广泛用于染色体计数、组 型分析、显带、显微操作、原位杂交等分子细胞遗传学研究领域染色组通常是指生物体细胞染色体所有可测定的表型特征的总称，包括染色 体的总数，染色体组的数目，组内染色体基数、每条染色体大小、形态等。

它是 物种特有的染色体信息之一，具有很高的稳定性和再现性染色组型分析是对染 色体进行分组，对核型的各种特征进行定量和定性的描述，如对染色体长度、着 丝点位置、臂比和随体有无等为细胞遗传学、分类学和进化遗传学等研究提供 实验依据实验用品】1.材料：蚕豆(Viciafaba)2．器材和仪器：恒温培养箱，显微摄影设备，载玻片，酒精灯，冰箱，恒 温水浴锅、135胶卷，剪刀，镊子，解剖针，刀片及毫米尺3.试剂：对二氯苯饱和溶液，甲醇，冰醋酸， 70%酒精，纤维素酶，果胶 酶，Giemsa 原液，1/15mol/L(pH6.8—7.2)磷酸缓冲液，0.075mol/LKCI方法步骤】1 .制片(1) .取材：先将种子浸泡若干小时，然后转人一垫有湿润滤纸的培养皿中， 置25°C恒温培养箱中萌发，待幼根长至1—2cm取材2) .预处理：将取下的根尖置于盛有对二氯苯饱和水溶液或1mL0.2%秋水 仙素的小瓶中预处理2—3小时3) .前低渗：将根尖，放入0.075mol/L氯化钾低渗液中，在25°C条件下处 理 30 分钟4) .酶解去壁：倒去 KCI 溶液，用蒸馏水充分洗净加人混合酶液(纤维 素酶与果胶酶各占2.5%)，25—30C下酶解2h左右，在酶解过程中最好轻轻 摇动瓶子，促使酶解反应更加充分。

5) .后低渗：倒去酶液，用蒸馏水慢慢冲洗2—3次，然后在蒸馏水中停留 10—30min 进行后低渗处理6) .固定：甲醇：冰酸酸(3： 1)固定液固定 30min7) .涂片：取 2—3 个根尖置于擦干的洁净载玻片上，切下顶端 1—2mm， 滴上 1 —2 滴甲醇—冰醋酸(3： 1)固定液，用镊子迅速捣碎根尖组织，均匀涂布 于载玻片上，在酒精灯火焰上掠过 3—4 次8) .染色： Giemsa 原液与 1/15M 磷酸缓冲液以20： 1 混合，分装入染色 缸，将干燥的制片置于染液中，也可将染液直接滴在载玻片上，染色时间约 30min， 然后自来水冲洗载玻片，空气干燥后即可进行镜检2．结果观察先在低倍物镜下进行观察，找到较好的中期分裂相后，直接加显微镜油并转 换为油镜头进行观察（若使用香柏油，则需加盖玻片，因为在香柏油中染色体会 褪色）选择较好的分裂相用显微镜上配备数码照相装置摄影3．摄影选择较好的分裂相用显微镜上配备数码照相装置摄影（记下放大倍数）冲 洗照片4．测量对照片测量各条染色体的长臂（P）短臂（Q）的臂长（分别量到着丝点中 部），特殊染色体的附加部分等的长度（毫米）5．计算有关指标的数值（指标指数）5．1 染色体数目 在同一物种中染色体的数目一般是稳定的。

应该注意的是，染色体记数不应 仅仅根据一个或少数结果细胞，一般要统计 30 个以上效果制片较好的细胞，然 后取其众数确定5．2 染色体形态 分析染色体形态时，一般利用体细胞分裂中期的染色体，因为此时染色体已 充分缩短而稳定而早中期或晚期的染色体正处于收缩过程中，各部分收缩程度 不大一致误差较大分析染色体形态常用如下指标：① 染色体绝对长度（或实际长度）均以微米（”m）表示一般在放大照片或描图上测量，按下列公式换算： 放大的染色体长度（m m）三放大倍数X100绝对长度不是一个可靠的，可比较的数值，因为预处理条件不同，染色体缩 短程度不同细胞分类学中，多用相对长度② 相对长度（relative©ngth, RL）均以百分比表示相对长度=染色体长度三染色体组分总长度X100③ 染色体长度比指核型中最长染色体与最短染色体的比值即：Lt/st=最长染色体三最短染色体可以简写成为Lt/st这一数值至今应用尚不普遍，但却很有价值④ 臂比（r）指同一染色体长臂（q）与短臂（p）的比值「=长臂长度（q）三短臂长度（p）臂比是划分染色体类型的重要指标臂比为1.0〜1.7的归为中间着丝粒染色 体，用m表示；1.7〜3.0的归为亚中间着丝粒染色体，用sm表示；3.0〜7.0 的归为亚端部着丝粒，用 st 表示； 7.0〜更大的归为端部着丝粒染色体，用 T 表 示。

用 SAT 代表具体随体的染色体，计算染色体长度时，可以包括随体也可以 不包括，但要注明⑤ 着丝点指数（centromereindex,CI）指短臂占该条染色体全长的百分比，它决定着丝粒的相对位置CI=短臂长三该条染色体全长X100⑥ 臂指数或 NF 值（numberfundamental）表示一个细胞染色体组型中所有染色体臂数的总和通常将着丝粒位于染色 体端部或亚端部的一条染色体臂数记为 1，把着丝粒位于染色体中部或亚中部的 一条染色体臂数记为 2⑦染色体编号 通常按染色体长度编号，如果两对染色体长度相等，则按短臂长度排列，长 者在前，短者在后性染色体排在最后⑧染色体组式指人为将染色体按相对长度，依大型（large,L）、中型（middle,M）、小型 （small,S）及性染色体顺序记数并列成简式，以明了染色体的构成成分如 3L+3M+2S,表示该物种具3对大型，3对中型，2对小型常染色体通常大型 染色体是指相对长度在10.00以上的染色体，中型染色体指相对相对范围在5〜 10的染色体，而5.00以下的为小型染色体6．将照片剪分成各单个的染色体按表型特征将全部染色体配同源对（或同源组），配对的根据是随体的有无 及大小，臂比是否相等，染色体长度是否相等。

7．将染色体全部的同源对排列①全部着丝点对齐在同一水平线上，②短臂朝上长臂在下，③按大小降序从 左到右依次排队（等长的染色体，短臂长者排在前头），④具随体染色体、性染 色体排放在最后（蚕豆染色体组型例外）；若有二对以上具随体染色体，则大随 体染色体在前，小随体染色体在后8．编上序号将排好的染色体对（组）按先后顺序粘贴在绘图纸上，编上序号 【实验结果】统计 30 个以上制片效果较好的分裂相图片，然后取其众数确定该物种的染 色体组型由图片可以看出豌豆根尖细胞染色体数目为2n=14,玉米根尖细胞染 色体数目为2n=20，水稻根尖细胞染色体数目为2n=24豌豆根尖 2n=14 玉米根尖 2n=20 水稻根尖 2n=24【注意事项】1 ．火焰干燥是温度不要太高，不能将玻片固定在火焰上烤，此步骤也可用 自然干燥代替2.对二氯苯饱和溶液处理时间应为3-4h,时间太长会损坏染色体外形，不利 于观察，时间太短起不到效果实验报告】对大麦或蚕豆等物种的染色体进行组型分析。