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AFLP 实验操作指南实验操作指南一、一、实验操作流程实验操作流程 1．． DNA 样本的准备样本的准备 把 DNA 样本用紫外光（或荧光）分光光度计精确的测取浓度，然后将其稀释成浓 度为 50ng/ul，体积为 50ul 的溶液，如果 DNA 样本不多，在保证浓度的情况下体 积可以适当减少 2．． DNA 酶切酶切 （（1））反应体系反应体系成 分体 积（ul）双蒸水11.4 缓冲液（Yellow buffer）4 EcoRI (10u/ul)0.5 Mse I (10u/ul)0.1 模板 DNA（50ng/ul）4总体积20（（2））反映程序反映程序37℃反应 3 个小时，最后保存于 4℃ （（3 3））检测检测取 4－6ul 酶切液进行酶切效果检测，跑出的带以弥散状、无明显主带为好 琼脂糖电泳用琼脂糖电泳用 6×loading6×loading bufferbuffer：名称用量（武汉）（武汉）用量（广州）（广州）Ficell 400 （蔗糖）12g40g EDTA(0.5M PH=8.0)12ul 10% SDS（十二烷基四磺酸钠）6mlBromphenol Blue（溴酚蓝）25mg25mg Xylene Cyanole FF（二甲苯 青 FF）25mg25mgddH2Oadd to 100ml100ml3 3．． 连接接头连接接头 （（1 1））接头的制备接头的制备 a a、、 按公司说明书将引物单链稀释成高浓度(一般是 5OD 稀释成 1650ng/ul)溶 液储存于－20℃冰箱。

b、、取部分引物单链稀释成 100uM/l，然后两条正反单链混合，体积比如下： 10ul EcoR1 正链、10 ul EcoR1 反链和 180ulTE 混合成 200ulEcoR1 接头； 100ul Mse I 正链、100 ul Mse I 反链混合成 200ul Mse I 接头c c、、反应程序：95℃下 5min，65℃下 10min，37℃下 10min，25℃下 10min，保存于 4℃ 最终储存于－20℃冰箱 （（2 2））连接反应体系连接反应体系成 分体 积（ul）双蒸水7.6 反应缓冲液（T4DNA 连接酶自带）2.5 EcoR1 接头1 Mse I 接头1 T4DNA 连接酶（5u/ul）0.4 酶切反应后溶液12.5总体积25（（3））反应程序反应程序21℃保存过夜附：酶切和连接之间不要停止附：酶切和连接之间不要停止 （（4 4））稀释稀释 按 1：10 的比列稀释，已稀释的和未稀释的均可长时间储存于－20℃备用 实验进行到此处可以暂停实验进行到此处可以暂停 4．． 预扩增预扩增 （（1））反应体系反应体系成 分体 积（ul）双蒸水10.3 缓冲液（10x Tag 酶自带）2 dNTPs(10Mm)0.4 EA00(50ng/ul)1 MC00(50ng/ul)1 MgCl2(25mM/l)( Tag 酶自带)1.2 Tag 聚合酶（5u/ul）0.1 稀释后已连接 DNA 模板4总体积20（（2））反映程序反映程序a a、、94℃ 2minb b、、94℃ 30sc c、、56℃ 1mind d、、72℃ 1mine e、、重复 b～d 25 次f f、、72℃ 5ming g、、保存于 4℃ （（3 3））稀释稀释 取部分预扩增后溶液按 1：25 的比例稀释(稀释比例可以自己适当调整)。

将已稀 释的和未稀释的保存于－20℃储存实验进行到此处可以暂停实验进行到此处可以暂停 （（4 4））检测检测 取未稀释的预扩增产物 4－6ul 进行琼脂糖电泳检测 5 5．． 选择扩增选择扩增 （（1 1））反应体系反应体系dNTPs(10mM)0.2EA--(15ng/ul) *2 MC--(15ng/ul) *2 MgCl2(25mM/l)( Tag 酶自带)0.6 Tag 聚合酶（5u/ul）0.1 预扩增稀释后模板2.5 总体积10 *:EA--,MC—后面两个碱基因不同引物对而不同 （（2 2）） 反应程序反应程序 a a、、第 1 个循环：94℃ 4min, 94℃ 30s, 65℃ 1min, 72℃ 1min； b b、、第 2～13 个循环：94℃ 30s, 65℃ 1min, 72℃ 1min（退火温度每隔一个 循环降低 0.7℃） ； c c、、第 14～36 个循环：94℃ 30s, 56℃ 1min, 72℃ 1min； d d、、72℃ 5min, 4℃保存 6 6．变性．变性（（1 1）） 变性剂（变性剂（LoadingLoading bufferbuffer）配方）配方组 分体 积去离子甲酰胺（Deionized Formamide）50mlEDTA(0.5M PH=8.0)1ml 二甲苯腈 FF(Xylene Cyanole FF)0.125g 溴酚蓝（Bromphenol Blue）0.125g （（2 2））变性变性将 3/4 体积（或者 1/2 即可）的变性剂加入 PCR 反应产物，95℃变性 5min，立 刻保存于 4℃或置于冰上直到上样电泳。

（（3 3）新的变性剂配方）新的变性剂配方组 分体 积终浓度去离子甲酰胺（Deionized Formamide）95ml95%溴酚蓝（Bromphenol Blue）50mg0.05%二甲苯腈 FF(Xylene Cyanole FF)50mg0.05%NaOH (100M)1ml(或直接称 0.04g)1M7.7. 制胶溶液制胶溶液（（1 1）） 一块胶的配方一块胶的配方 将 12ml 5X TBE 和 25.2g 尿素（Urea）混合加水定容至 51ml，向其中加入 9ml 40％的丙烯酰胺溶液，400ul 10%过硫酸胺（APS）和 30ul 四甲基一二胺 （TEMED） （（2 2）） 各组分配方各组分配方5X5X TBETBE：：54g Tris 碱（Tris-base）,27.5g 硼酸（B-acid）和 20mlEDTA(0.5M,PH=8.0)混合定容至 1000ml （室温放置）尿素储备液尿素储备液：270g 尿素，加入 120ml5X TBE，再加少量的水即可定容到 510ml切记加水要慢！非常容易过量，大约 100ml 左右即可 （室温放置）4040％丙烯酰胺溶液：％丙烯酰胺溶液：2g 甲叉丙烯酰胺（N、N-Methylene Bisacrylamide）,38g 丙烯酰胺（Acrylamide）混合加水定容至 100ml。

（4 度保存）1010％过硫酸胺溶液：％过硫酸胺溶液：1g 过硫酸胺（APS）加水定容至 10ml （4 度保存）8.8. 亲水和疏水处理及灌胶亲水和疏水处理及灌胶 （（1 1）） 长玻璃（亲水玻璃）处理：a a、、亲水剂制备：1.5 ml 95%酒精，3ul 亲水硅烷（Binding Silane）,7.5ul 冰醋酸混合此为一块板用量b b、、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好待晾干后再开始亲水处理c c、、先用约 2ml 95％的酒精涂擦玻璃板，保证板子清洁 d d、、用手巾纸浸亲水剂涂擦玻璃板e e、、干燥 5 分钟，用约 2ml 95％的酒精再轻轻涂搽玻璃板（以均一方向）然 后再垂直方向涂擦一遍e e、、晾干约 10min（不少于 10min） 2 2）） 短玻璃（疏水玻璃）处理a a、、换手套，以防亲水剂和疏水剂交叉污染如果出现污染情况，可将玻璃浸 入 10％的 NaOH 溶液中b b、、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好待晾干后再开始疏水处理 c c、、 用纸巾浸疏水剂(Repel-silane ES)涂搽玻璃板，要均匀 d d、、 用约 2ml 95％的酒精涂擦玻璃板，保证板子清洁。

e e、、干燥 5 分钟，用约 2ml 95％的酒精再轻轻涂擦玻璃板（以均一方向）然 后再垂直方向涂擦一遍f f、、晾干约 10min（不少于 10min） g g、、疏水处理做一次大约可以跑 5 块胶再做或当出现轻微扯胶情况时再做3 3）） 将长玻璃放在水平的泡沫垫上，亲水面向上，将两个胶条平行分置于其较 长的两边，然后轻轻放上疏水玻璃，疏水面向下这样在两玻璃间形成了一个 矩形空隙用夹子夹住固定4 4）） 用胶带将左右两边和底边封上，留出插梳子的边（有凹边的那一边） ，封时 要均匀不留气泡5 5）） 将梳子插入有凹边的缝隙，看是否容易均匀，不行要适当调整6 6）） 将有凹边的那边稍稍垫高，然后配胶用注射器筒灌入，要从一边均匀灌入， 胶中不留气泡7 7）） 将梳子平直边插入凹口缝隙，以形成一个胶的平直端注意其端线应与玻璃 板的长边垂直8 8）） 让胶至少聚合两个小时9.9. 电泳电泳（（1 1）） 将电泳槽底盒装入 400ml 1X TBE 缓冲液，上盒装入 500ml 1X TBE 缓冲液2 2）） 轻轻拔掉梳子，固定玻璃于电泳仪上，到入上盒缓冲液，用 1000ul 枪冲洗 凹口缝隙，冲干净为好，65W 预电泳 30min。

3 3）） 预电泳完毕断开电源，再次冲洗缝隙，然后将梳子齿端插入凹口缝隙，其齿 尖端轻轻的插进胶中，以构成点样孔4 4）） 点入 3.0～4.5ul 变性后的样品5 5）） 65W 电泳约两个半小时，直到上边那条浅蓝色的指示带到离顶端 2/3 为好6 6）） 电泳完毕，分开两玻璃板，将固着胶的亲水板放入预先准备好的 10％的醋 酸固定液中浸泡固定脱色10.10. 银染银染（（1 1）） 脱色：脱色：2 升 10％冰醋酸溶液（固定/停止液） ，轻轻摇 20 分钟至全部脱色 附 10%冰醋酸配方：200ml 冰醋酸与 1800ml 双蒸水混合2 2）） 冲洗：冲洗：用双蒸水漂洗三次，每次 5 分钟3 3）） 染色：染色：加染色液，染色 20～30 分钟附染色液配方（用前 10 分钟配）：在 两升双蒸水中加入 2g AgNO3，3ml 37％甲醛4 4）） 漂洗：漂洗：双蒸水冲洗胶板不超过 5 秒钟5 5）） 显影：显影：在 2 升冷却的显影液中轻轻的摇动，直至带纹的出现附显影液配方： 在 2 升双蒸水中加入 60g NaCO3，完全溶解后放入 4℃冰箱冷却至 4℃（可在使 用前 5 小时配） ；使用前 5 分钟加 3ml 甲醛，10mg/ml 硫代硫酸钠 400ul。

6 6）） 定影：定影：加入等体积的固定/停止液（即脱色中所用的） ，固定 2 分钟7 7）） 冲洗：冲洗：用双蒸水冲洗 2 次，每次 2 分钟8 8）） 胶的干燥：胶的干燥：室温下自然干燥10.10. 新银染方法：新银染方法： （1）将凝胶浸在固定液（10% 乙醇，0.5% 冰醋酸）中 5 min；（胶面向下？） （2）将凝胶浸在染色液 （10%乙醇, 0.5% 冰醋酸, 0.2% AgNO3）中 8 min；（胶 面向下？） （3）在水中短时间地冲洗凝胶（5-10 秒） （4）将凝胶浸在显影液（3% NaOH, 0.1% 甲醛）中，直到带纹出现 （胶面向上） （5）将凝胶浸在固定液中固定 5min溶液配方： 固定液：无水乙醇 100ml，冰醋酸 5 ml, 水 895 ml； 染色液：无水乙醇 100ml，冰醋酸 5 ml, 水 895 ml，AgNO3 (ACS 试剂) 2g； 显影液（每次使用都要新配）：30 g NaOH, 1ml 甲醛, 水 1000ml. 。