土壤的稀释分离.docx

土壤的稀释分离、纯化微生物及无菌操作技术 录入时间:2008-10-21 11:05:59 来源：青岛海博一、实验目的和内容 目的：学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术内容：1. 用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌2．用平板划线方法分离微生物3.学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术二、 实验材料和用具金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和普通变形菌（Proteus vulgaris）斜面菌种已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶，49.5mL无菌水（带玻璃珠）1瓶， 4.5mL 无菌水6管， 80%乳酸， 10%酚液， 95%乙醇无菌培养皿 12 套， 1mL 无菌移液管 10 支，土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻 璃铅笔、橡皮头（用 75%乙醇浸泡）、玻璃刮三、 操作步骤（一）土壤稀释分离1. 取土壤 取表层以下5一10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4°C冰箱中暂存2. 制备稀释液（要无菌操作）（1）制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中（玻璃珠用量以充 满瓶底力最好），振荡5~10min,使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。

⑵稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液， 如此重复，可依次制成 10-3~10-8 的稀释液（图 3-1）注意：操作时管尖不能接触液面，每 一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸 3 次，每次吸上 的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差3. 混菌法测定菌落数的方法（1）细菌：取10-7、10-6两管稀释液各1mL,分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两 个平皿然后取冷却至50C的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满皿底 高 1.5~2mm 为宜），迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘， 待琼脂凝固即成细菌平板倒平板时要注意无菌操作，见图 3-2图 3一2 倒平板的方法（2） 放线菌：取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液5〜6滴，摇匀，静置片 刻，然后分别从两管中吸出1mL加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌 相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板3） 霉菌：取10-2、10-3两管稀释各1mL,分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两 个平皿。

在融化的土豆蔗糖培养基中，每100mL加入灭菌的乳酸1mL,轻轻摇匀，然后用 与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板4. 培养将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28〜30 中恒温 培养，细菌培养1〜2d，放线菌培养5〜7d,霉菌培养3〜5d观察生长的菌落，用于进一 步纯化分离或直接转接斜面二） 平板制作及划线分离方法1. 倒平板 按无菌操作要求，在火焰旁操作（图 3—2），做法如 3（1）2. 划线分离 使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样，在相应 培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落，主要方法参见图 3—3三） 斜面接种和穿刺接种1 .斜面接种（1） 取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无 菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上2） 接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方 向是从下部开始，一直划至上部（图3—4A）注意划线要轻，不可把培养基划破3） 接种后30°C恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至抱子成熟方可取出保存2. 穿刺接种（1） 取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记（写上菌名）、接种日期，接种 人等）。

2） 接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底部（但 不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动3） 接种后30C恒温培养，24h后观察，比较两种菌的生长结果四、 注意事项1. 一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故 从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数2. 在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确3. 放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多五、 实验报告1. 记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量 计算方法：选择长出菌落数30〜300之间的培养皿进行计数，按以下公式： 总菌数/g=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数2. 分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价3. 比较两种细菌穿刺接种的结果，并进行分析 七、问题和思考1. 在测定土壤微生物含量中，除混菌法外还可用什么方法?2. 试设计实验，从土壤中分离出酵母菌，并进行计数。