大豆化叶病毒外壳蛋白基因的克隆和其在大肠杆菌中的表达.doc

i偌-兀3生物工程学报0( 3)：198—203)993Chinese Journal of Biotechnology大豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和其在大肠杆菌中的表达刘俊君址匮x/李荔莽克强 —n（甲ST丽丽胡!研究所植物生钩工且开敖实酸宣,北京IOOO8O）7^ 95厶* 47通过多聚酶连锁反应（PCR>,我们合成了包括病毒外光蛋白基因在内的病毒基因组3,端 区域，并完成了其全部序列分析，比较SMV（北京分离物）和SMV・N株的序列发现，外先壷 白基因的核昔酸序列同源性达93.4%,其氨基酸序列同源性高达08.5%,就基因组3,端非编 码憚列而言，其同濒性达88.8%Western blot分析结果裏明所克薩的cDNA片段在夭肠杆 苗JM107中能表达正常的病毒外壳蛋白» 七关■闵 大豆花叶病毒・处醪進因.站沁" 大豆花叶病毒（Soybean Mosaic Virus）是马铃薯Y病每组的車要成员之 一，SMV基因组是单一正链RNA,长约 10kb,病每外壳蛋白基因位于基因组的 3,末端非编码区的上游"打SMV在我国 大豆各主要产区普遍存在.其发病率一般 为20—80%,重灾年份，个别地区发病率 可达100%,对于大豆生产影响很大。

除 影响产量外，同时引起大豆种子斑驳，降 低大豆品质（“将病毒外壳蛋白（Coat protein）基因导入伙物休内产生的转基因 植株在抗TMV、CMV等感染方面国内 外均有成功的报道，基于我国在大豆原生 质体再生和转化方面有相当工作基础z）, 因此利用同祥的原理，可望在大豆抗病 育种上取得一定的突破本文利用国内 SMV北京分藹物（SMV-BJ）为痒源， 通过多聚酶连锁反应方法，合成和修饰了 SMV外売蛋白基因，报道了包括SMV3, 端非编码区城在内的外壳蛋白基因的核昔 酸顺序及其在大肠杆菌内的我达结果材料和方法（一）材料1•毎协采•自中国科学院遗传硏究所本文于1佃2年5月5日收到.$工作为中31科学睨大科研锁目的课题•基因表达. . 、"1 1 — ■ I*试验农场2. cDNA合成试剂盒和Taq DNA 聚合酶购自Promega公司，T7DNA聚合 酶序列分析试剂盒、限制酶等生化试剂购 自 Boehringer 公司，a-35S-dATPs a- "P-dATP为NEN产品）PCR引物由中 国科学院微生物研究所技术室合成二〉方法1・病诲纯化和病每RNA分离『瘴 源摩擦接种大豆幼苗第一对真叶发病后， 收集的病叶经组织捣碎机匀浆，四氯化碳 澄清，再经过蔗糖垫（20%）差速离心和硫 酸锥梯度《10%—40%）离心，得到病毒纯 化物，病毒RNA按照常规SDS■酚法抽提 纯化2. cDNA合成和PCR扩增CP基因： 取0.1—0.5临SMV-RNA为模板•以 oligo（dT）l6为引物，根据cDNA合成试 剂盒要求，合成单链cDNA,根据巳经发 表的SMV-N株系址因组3,端核昔酸序 列（门，设计并合成PCR的两个引物，用 于SMV-CP基因的扩增。

5’ 端引物，5'CTCCATG GCA GCC AAG GAG AAG GAA GG3'3"端引物，5’ TTG TCG ACA ACA AAC ATT GCC GCA C3‘为 了便于基因摊作，将CP基因插入双元穀 体，以及基因在细菌和裔等植物体内的表 达，在PCR 5’端引物中引入了起始密码 ATG和限制閒Ncol位点，在PCR3Z端引 物中包含polyA区域的两个碱墓及一个 Sall位点，取2.5M单链cDNA,进行PCR 扩增，94七变性反应1 min, 56°CM性反 应1 min, 72七延伸反应2 mir,循环周 期30个，PCR产物经电泳检査以后，平 头连接到pBluescript KS载体的EcoRV 位点内，转化大肠杆菌XL-l blue菌株， 在含有JPTG和X・gal的氨节音襌素LB.¥ 板上挑选白色重组菌落’• ’3. CP基因克隆的限制酶分析以|及 全序列测定，重组质粒选用BamHI；- Ncol、Sall和PstI迸行酶解，在0.8%的 琼脂糖凝胶上电泳分析丫以确定CP基因的 插入方向及其酶谱通过CP基因内BamHI 和PstI位点，做两个亚克隆于pBluescript KS质粒中，参照KuchuanHsiao方法【厂 对重组质粒及两个亚克隆进行序列分析。

4. 蛋白质分析$将克降•于pBlues・ cript KS质粒内的CP基因通过• EcoRT/ Sail切出，插入PUC18对应悅点，转化 JM107,在含有IPTG及X-gal平皿上挑 选阳性菌落，接种于LB培养液中，经过 IPTG诱导后，离心收获细菌苗体蛋白 经过样品处理液（0,0625mol/JL Tris-HCl PH6.8, 2% SDS, 10% 蔗糖，5%0・ 瓠基乙醇儿100七处理5min以后，用 Tricine-SDS-PAGE分离以病毎外丸 蛋白为阳性对照，PUC18转化的大肠杆 菌JM107菌体竟白为阴性对照一块凝胶 用Coomassie亮蓝染色，用 于 Western blot分析的另一块凝胶转移至硝酸纤维素 膜上，用洗涤缓冲液（20mmol/L Tris- HC1 pH7.4, 150mmol/L NaCIJmmol /L EDTA, 0.1% Tween-20, 0.04% NaNJ+5% BSA,于37弋保温60min, 进行预包被，加入抗血清，37弋保温60 min后，用洗涤缓冲液冲洗3次，然后与 稀秤的碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG保 温60min,同样琵虞以后，在ALP缓冲液 （100mmol/L NaCI, smmol/L MgCl2* 6HtO, 100 mmol/JL Tais-HCl pH 9.5） 中洗涤数分钟，•与康楡溶液（10ml ALP• • ・中含 3.3mg NBT, 1.65 mg BCIP, 100 Q二甲基甲酰胺）反矗显色W• •I宀•・• . - < . *' . I'Z结果'与讨论'（一〉提取病寄纯化物Becfcnan DU・7 紫外扫描仪分晞 显示炳呼特征吸收曲线。

用3 %鳞第散负在电镜下可观察 到正常大小的［輕旷科粒子纯化的 SMV-RNAIB（M%声咖糖电泳分析，显 示单一的磁酸帯八降離甚微（见图1）,这 些证据说明，杀•程序提取的病毒基本上是 纯净的二）SMV^CP «S的限制■■切分析和全序列测庭单链cPNA的PCR产物，经电泳检査，为长约lkb的单〒片段，与预期大小 一致（见图2）PCR产物平头插入明加・ escript KS EcoRV,位点，所得章组质粒 命名为PLM （见图3 ）•经几种限制酶酶 切分析发现（PLM具有SMV-N株系©P 基因相同的位点通过对质粒PLM及其亚克隆进行序 列分析，获得了 SMV-BJ基因组3;端区 域的核昔酸序列（见图4）比校.SMV・bS 1 SMV-RNA电冰閔Figei The electrophoresis pattern of SMV^RNA a.TMV-RNA

马铃薯Y病 懈组成员各株系的外壳蛋白差异一般多表 现在蛋白的N-mt7\但是.SMV-BJ和 SMV-N抹外弟蛋白的氨基酸差异有两个 发生在CJSh分别为第257和第264位就 其3’端非编码序列而言，其同源性超 88.8%,其中SMV-N株有两个终止密 码，而SMV-BJ仅有一个终止密码这 些证据表阴，SMV-BJ和SMV-N株磁 缘的两个不同株系