高效液相色谱法测定生物样本中头孢噻肟和舒巴坦的浓度.doc

1高效液相色谱法测定生物样本中头孢噻肟和舒巴坦的浓度作者：顾宜，王晓娟，王荣，白娟娟，高苏莉【关键词】 头孢噻肟；舒巴克坦；色谱法,高压液相；血浆；尿【Abstract】 AIM: To establish a determination method of concentrations in human biologic sample following intravenous administration of cefotaxime and sulbactam. METHODS: A RPHPLC method was developed and validated to determine cefotaxime and sulbactam in plasma and urine. The mobile phase of cefotaxime and sulbactam consisted of 1 g/L triethylamine (regulated with phosphate acid to pH=6.2) and methanol in a 68∶32 and 84∶16 (v/v) respectively and pumped at a flow rate of 1 mL/min. The plasma samples were deproteinated by addition of methanol, the urine samples were diluted with super pure water, then 20 μL of supernatant was injected onto a C18 column and monitored with UV detector at 254 nm and 220 nm respectively. RESULTS: The assay of cefotaxime in human plasma and urine were linear over the range of 5.3-530.0 mg/L and 5.45-545.00 2mg/L respectively, with the detection limit of 1 mg/L and 0.25 mg/L respectively. The assay of sulbactam in human plasma and urine were linear over the range of 1.04-208.00 mg/L, with the detection limit of 0.50 mg/L and 0.25 mg/L respectively. The average recovery of the method was (89-110)%, and the RSD within and between days were all less than 5%. The cefotaxime and sulbactam sample of plasma and urine stored in a -20℃ refrigerator became stable within 3 d. CONCLUSION: The assay method is rapid, accurate and usable for the determination of cefotaxime and sulbactam concentrations in plasma and urine.【Keywords】 cefotaxime; sulbactam; chromatography, high pressure liquid; plasma; urine【摘要】 目的：　为静滴注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠后在血浆和尿液中的药物浓度分析提供检测方法. 方法：　采用 HPLC 测定头孢噻肟钠血浆和尿液中浓度. 在血样中加入甲醇沉淀蛋白后，尿样用超纯水稀释后取上清液进样，色谱分析条件: 以 C18 反相柱作分析柱；柱温：室温；流速： 1 mL/min；头孢噻肟和舒巴坦的流动相分别为：1g/L 的三乙胺水溶液（用磷酸调 pH 值 6.2）∶甲醇＝68∶32 和 84∶16；头孢噻肟和舒巴坦的紫外检测波长分别为3254 nm 和 220 nm. 结果：　头孢噻肟血样和尿样的线性范围分别为 5.3～530.0 mg/L 和 5.45～545.00 mg/L，最低检测浓度分别为1.00 mg/L 和 0.25 mg/L；舒巴坦血样和尿样的线性范围为1.04～208.00 mg/L，最低检出浓度分别为 0.5 mg/L 和 0.25 mg/L；方法平均提取回收率在 (89～110)%之间；日内、日间RSD 均小于 5%. 头孢噻肟和舒巴坦血浆和尿液样品置于-20℃冰箱3 d 内稳定. 结论：　本方法具有快速、简便、灵敏、准确等特点,适合于头孢噻肟和舒巴坦血浆和尿液浓度测定.【关键词】 头孢噻肟；舒巴克坦；色谱法，高压液相；血浆；尿0 引言由湘北威尔曼制药有限公司开发研制的一类复方新药注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠已经国家食品药品监督管理局批准进行Ⅰ期临床试验（临床研究批件号：2005L00727）. 头孢噻肟钠属第三代半合成头孢菌素类，其抗菌谱广，对革兰阴性菌、革兰阳性菌、需氧菌和某些厌氧菌均有较好的抗菌活性，特别对革兰阴性菌的杀灭作用更强. 随着头孢噻肟在临床的广泛使用，许多临床病原菌通过产生 β 内酰胺酶对头孢噻肟产生耐药性而导致临床治疗方案的失败［1-2 ］. 舒巴坦为半合成 β 内酰胺酶抑制剂,与头孢噻肟合用时出4现协同作用，使对头孢噻肟耐药的细菌的最低抑菌浓度下降到敏感范围之内. 为了评价静滴注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠后该药品在健康志愿受试者的耐受性以及药代动力学特点，我们采用高效液相色谱法测定了生物样本中头孢噻肟和舒巴坦的浓度.1 材料和方法1.1 材料 Beckman 公司 System gold 高效液相色谱仪（125 型二元梯度泵，7725i 手动进样器，20 μL 定量环，168 型紫外检测器，32 Karat TM Software）. 头孢噻肟、舒巴坦对照品（中国药品生物制品检定所） ，甲醇为色谱纯（迪马公司） ，水为自制超纯水，其余试剂均为分析纯.1.2 方法1.2.1 色谱条件色谱柱： 迪马公司 Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm, 5 μm） ；柱温： 室温；流速： 1 mL/min；进样量：20 μL. 头孢噻肟流动相： 1 g/L 的三乙胺水溶液（用磷酸调 pH值 6.2）∶ 甲醇＝68∶32；头孢噻肟紫外检测波长： 254 nm. 舒巴坦流动相： 1 g/L 的三乙胺水溶液（用磷酸调 pH 至 6.2）∶甲醇=84∶16；舒巴坦紫外检测波长： 220 nm.51.2.2 样品处理血样处理： 精密量取血浆 0.2 mL，置 1.5 mL 尖底离心管中，加入甲醇 0.5 mL，漩涡混合 0.5 min，离心（4200 g） 20 min，取上清液 20 μL 进样. 尿样处理： 将尿液用水稀释 10～200 倍后，漩涡混合 0.5 min，用 0.45 μm 微孔滤膜滤过，取 20 μL 进样.2 结果2.1 色谱图头孢噻肟对照品溶液、空白血浆、健康受试者给药后的血浆样品的色谱(图 1)，空白尿液、给药后的尿液样品的色谱(图 2)，其中头孢噻肟保留时间约为 5.8 min；舒巴坦对照品溶液、空白血浆、健康受试者给药后的血浆样品的色谱(图 3)，空白尿液、给药后的尿液样品的色谱(图 4)，其中舒巴坦保留时间约为 4.5 min. 结果表明，空白血浆、空白尿液中杂质不干扰测定.图 1 头孢噻肟(1) 对照品溶液（A）,空白血浆（B）,健康受试者给药 6 h 后的血浆样品（ C）的色谱图（略）图 2 头孢噻肟(1) 空白尿液样品（A） ,健康受试者给药 4 h 后的尿液样品（B）的色谱图（略）图 3 舒巴坦(1)对照品溶液（A）,空白血浆（B）,健康受试者6给药 2 h 后的血浆样品（ C）的色谱图（略）图 4 舒巴坦(1)空白尿液样品（A）,健康受试者给药 2 h 后的尿液样品（B）的色谱图（略）2.2 标准曲线2.2.1 头孢噻肟标准曲线方程取空白血浆 0.2 mL，加入适量对照品溶液，使血浆中头孢噻肟浓度依次分别为 5.3, 10.6, 53, 106, 212, 318, 424 和 530 mg/L，按照血浆样品制备方法制备，在上述色谱条件下，进样 20 μL，测定对照品峰面积 . 以色谱峰面积（A ）对头孢噻肟浓度 C（mg/L）作加权线性回归(权重为 1/C2)，求得线性方程为 A=8770.487C+10391.277, R2=0.9994. 线性范围为5.3～530.0 mg/L（n=8 ）. 血浆中头孢噻肟的最低检出浓度（按信噪比≥3 计）为 1 mg/L. 尿样中头孢噻肟色谱峰面积（A）对浓度C（mg/L ）作加权线性回归(权重为 1/C2)，求得线性方程为A=37055.42C+78893.03, R2=0.9998. 线性范围为 5.45～545 mg/L（n=8） ，尿样中头孢噻肟的最低检出浓度（按信噪比≥3 计）为 0.25 mg/L.2.2.2 舒巴坦标准曲线方程取空白血浆 0.2 mL，加入适量舒巴坦对照品溶液，使血浆中舒巴坦浓度依次分别为 1.04, 2.08, 5.20, 710.4, 52, 104 和 208 mg/L，按照血浆样品制备方法制备，在上色谱条件下，进样 20 μL，测定对照品峰面积 . 以色谱峰面积（A ）对舒巴坦浓度 C（mg/L）作加权线性回归(权重为 1/C2，图 4)，求得线性方程为 A=1681.319C+779.655, R2=0.9996. 线性范围为1.04～208 mg/L（n=7）. 血浆中舒巴坦的最低检出浓度（按信噪比≥3 计）为 0.5 mg/L. 以尿样中舒巴坦色谱峰面积（A）对浓度C（mg/L ）作加权线性回归(权重为 1/C2)，求得线性方程为A=5415.424C+1753.765, R2=0.9994，线性范围为 1.04～208 mg/L（n=7）. 尿样中舒巴坦的最低检出浓度（按信噪比≥3 计）为 0.25 mg/L.2.3 提取回收率分别用甲醇配制头孢噻肟对照品溶液和舒巴坦对照品溶液，同时制备相同浓度的血样和尿样并依法处理，分别进样分析，以血样和尿样中药物峰面积与对照品峰面积比值计算提取回收率(表 1).表 1 血样和尿样中头孢噻肟和舒巴坦提取回收率（略）2.4 方法精密度2.4.1 头孢噻肟方法精密度取空白血浆加入适量头孢噻肟对照品，配制成低、中、高浓度分别为 10, 100 和 400 mg/L 血浆样品，8在 1 d 内按样品测定法重复测定 6 次，求得日内 RSD 分别为2.74%, 2.21%和 3.40%. 将上述 3 个浓度的样品在 3 d 内连续各重复测定 6 次，求得日间 RSD 分别为 3.13%, 2.85%和 3.85%.2.4.2 尿液中头孢噻肟方法精密度取空白尿液加入适量头孢噻肟对照品，配制成低、中、高浓度分别为 10, 100 和 400 mg/L 尿液样品，在 1 d 内按样品测定法重复测定 6 次，求得日内 RSD 分别为 1.52%, 1.30%和 1.14%. 将上述 3 个浓度的样品在 3d 内连续各重复测定 6 次，求得日间 RSD 分别为 1.44%, 1.78%和 1.30%.2.4.3 血浆中舒巴坦方法精密度取空白血浆加入适量舒巴坦对照品，配制成低、中、高浓度分别为 2.08, 10.4 和 104 mg/L 血浆样品，在 1 d 内按样品测定法重。