【精品】幽门螺杆菌分离培养和鉴定.doc

幽门螺杆菌分离培养和鉴定C02气瓶、N2气瓶、C02气袋、N2气袋、厌氧培养瓶、负压泵、 通气管道（带阀门）、培养箱、生物安全柜、酒精灯、接种环、普通 天平、电子天平、高压锅、玻片、显微镜、香柏油、平皿、三角瓶（带 盖）、10ml吸管、1ml吸管、吸头、200）11冻存管、细胞冻存管、普 通冰箱、低温冰箱（-80C）、液氮罐、无菌滤器、加样器、无菌注射 器、眼科镶（带弯头）2. 实验材料：牛脑心浸液或布氏肉汤、月示蛋白豚、胰豚、氯化钠、磷酸氢二 钠12H2O2/无水、琼脂粉、抗生素（万古霉素、多粘菌素、二性霉素）、 羊血、葡萄糖（1小牛血清、氢氧化钠（2M）、蒸馅水、甘油、 淀粉、dH试纸、革兰染液、快速尿素酶试纸、过氧化氢（3%）、氧 化酶试剂、0-环糊精、酵母提取物、重亚硫酸钠、遗糖、淋球菌转运 培养基3. 有关试剂的配制：（1）选择剂：万古霉素（10mg/l）、多粘菌素（2500U/1）、二性霉 素（10mg/l）,三甲氧苯氨嗟嚏（TMP） （5mg/l）o称量溶解后,采用 抽滤除菌，按照每次配制200 ml培养基所需量（1ml）分装，-20C 保存备用半年注意：二性霉素不易溶解，抽滤时多数被滤除）（2） Hp培养基（牛脑浸液）配方:牛脑浸液100ml、牛心浸液125 ml、月示蛋白腺5g、氯化钠2.5g、 磷酸氢二钠1.25g,加水至500ml （加水275ml）、琼脂粉（1.5%） 7.5g。

加热溶化后调pH至7.6-7.8以200ml分装，灭菌血平板：200 ml上述培养基中加入10%葡萄糖10ml （5%）、抗 生素1ml （0.5%）、羊血10ml,混匀后倒入无菌平皿注：羊血需要 量入，不能够随便加入，要保证加入的量，宁多勿少（重庆医科大学 加 7%）3） Hp牛脑浸液培养基：上述未加琼脂粉的液体培养基20 ml 加小牛血清2 ml （10%）, 10%的葡萄糖1 ml （5%）一般不加抗生素,如果加，按照0.5%加入加淀粉0.1g （0.5%）4）布氏琼脂：月示蛋白豚10g、胰豚10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠12H2O26.3g （无水2.5g）、酵母提取物2g、重亚硫酸钠0.1g、P-环糊精2g,加水 1000mlo按照1.5%-2.0%加入琼脂粉，琼脂粉需要分开加，一般分装 到100-200ml时按量加入加热溶化后，高压灭菌前调pH至7.7左 右经验：3000ml+2M NaOH 8ml）注意：培养基每次制备200ml或更少，用时，溶化琼脂，加入一定量的葡萄糖、小牛血清或血液，加样用灭菌的吸管扩增用培养IIIIII基（纯培养）不需要加入抗生素，临床标本分离用时必须加入抗生素。

5）运送培养基：重庆医科大学采用淋球菌的运送培养基（改 良stuart运送培养基）/将胃粘膜组织置于小牛血清布氏肉汤运送培养基中送检/庶糖10g,经56C灭活的小牛血清10ml,布氏肉汤100ml（称取布氏肉汤粉剂2.8g,加蔗糖10g,加水90ml,高压灭菌，加小 牛血清10ml,无菌分装，4C保存备用，7天内有效）6）保存液：20%甘油+5%小牛血清+Hp液体培养基4. 样本采集和接种：重庆医科大学（1） 胃镜处理：不能够用太浓的戊二醛，消毒结束后活检钳要 反复用自来水冲洗，活检钳头部要用干纱布把水擦干，以防活检钳中 储存消毒水，否则阳性率很低2） 标本取出后要防止污染，用无菌的镶子夹取后放入到淋球 菌转运培养基中（半固体培养基）3） 标本采集前作快速尿素酶试验，"++”以上者才取材，两个 以+者不用取材，分离阳性率低4） 标本送到实验室后在接种前最好放得干一点，太湿的话 不容易成功5） 标本用分区划线的方法划开第三军医大学1）临床标本分离程序：在胃镜室将胃粘膜放在平皿上，用无菌 镶压一下，防止掉落不能够在胃镜室时间太长，否则会死亡拿到 实验室后，用无菌的眼科镶（弯头）在平皿表面反复涂划一区（一区 划的面积不要太大，尤其是动物的胃标本，其中的杂菌太多），然后 用接种环用分区划线的方法将其在培养基表面分开。

2）纯培养程序：将分离培养的可疑菌落或储存的菌种直接用连 续划线或分区划线接种即可注意：如果是挑选的可疑菌落，最好一 个菌落划一小区，一,块平板可以多划儿个小区，将来经过鉴定可以选 出真正的Hp来3）液体培养：准备20ml的肉汤培养基，用无菌的吸管吸取2ml 加入到固体平板纯培养物中，用L棒反复推洗，将细菌洗下，吸取全 部菌液，加入到液体培养基中，注意：锥形瓶的盖子不能够拧得太紧, 有助于气体进入设置微需氧条件摇床培养24小时，振荡培养箱 的振荡速度80-130r/min,终止培养，观察液体的透亮度，吸取菌液, 革兰染色后观察形态，形态不典型者，转种Hp固体平板培养基，再 次分离培养（-20C保存可等一周），吸取液体培养产物50U1,加入 固体培养基中，用接种环划线散开注意：液体培养只能用于增菌，对于标本中混合有杂菌的标本， 不能使用5. Hp的培养：（1）微需氧条件（5%氧气、85%氮气、10%二氧化碳）建立： 采用抽气换气法将培养基放入厌氧培养罐，拧紧螺丝，首先用负压 泵抽气至表・0・06的位置，（不能够完全抽空，目的是留5%的氧气）， 关上抽气阀，打开氮气控制阀至-0.01,随后关上氮气阀，打开二氧化 碳气阀，充气至0,随后关上厌氧罐的阀门。

2)湿度控制：在厌氧罐中放入一装水的青霉素瓶，打开瓶塞,保证湿度3)培养温度：35-37C, 3-5天观察结果注意：①培养瓶必须保证不漏气，进行全方位检测合格后方可充气培养；每次观察结束后需要继续培养者必须重新充气；②由于胃液 存在多种过路菌，一般原代培养不使用液体培养基；③为提高阳性率 并防止污染，原代培养可应用非选择性和选择性培养平板各1块；④ 条件好的实验室在接种3天后每天观察一次，条件差时，打开培养罐 次数过多可能增加污染机会6 .培养物:Hp的菌落为无色半透明，针尖大小，似露滴状菌落数可能较少(甚至每块板只有1个)，需仔细对光观察以免遗漏；L棒接种菌 量大时，菌落在培养板表面融合成一层半透明的菌苔液体培养24 小时结束，固体平板版的纯培养2-3天结束，临床标本分离3-5天结 束临床分离物中，由于存在较多杂菌，因此需要耐心的寻找“可疑 菌落即无色半透明，针尖大小，似露滴状”，随后转种血平板，转种 时可以多分区域，每个区域种几个可疑菌落，最后鉴定7 .临床分离株鉴定:(1)首次从平板中分离出的可疑菌落往往很小很少，直接鉴定存在一定的困难，因此除非在有很多菌落的情况下，否则必须作纯培 养后继续鉴定。

2) 革兰染色：从临床标本分离的Hp形态往往很典型，呈细 长，弯曲，S型或海鸥展翅状，革兰染色阴性此有重要鉴别价值！据此基本可以确诊因为胃内很少有杂菌，更何况形态如此典型的杂 菌3） 快速尿素酶试验：购置快速脉酶试纸（福建产品），将可以 菌落涂抹上去，很快显色者即为尿素酶试验阳性4） 触酶试验：在玻片上滴加1滴3%过氧化氢，刮取可疑菌落 置入后，阳性者可见到连续的氧气泡形成5） 氧化酶试验：取菌落少许，涂抹在氧化酶试纸上，变色者 为阳性8. 标本的贮存方法纯培养的Hp平板（48-72小时），加入2ml保存液,L棒推洗后, 吸取200 u 1至冻存管（200 U1的印pendof管），写好标签，放入低 温冰箱（-80C）o如果为液氮保存，冻存时要用细胞冻存管，防止冻 裂如果为液体培养基，培养24小时后，离心浓缩细菌，收集沉淀 物，加入20%甘油，5%小牛血清即可保存注意：细菌冻存时每一种细菌每次可以多冻几支，每次在使用时 只需要拿出1支复苏就可以，反复冻融对细菌的损害甚大9. 冰冻标本的复苏低温保存的Hp,取出后融化，离心，吸取沉淀，直接接种Hp 血平板，微需氧条件培养即可10 .标本档案建立为了满足研究需要，每次在采集标本时，需要收集患者的详尽情 况，因此需要制定有关的问卷表格进行调查。

每株细菌建立详尽的档 案，以便将后的研究使用。