代谢调节与代谢工程.ppt

代谢调节与代谢工程(1).直线式代谢途径中的反馈抑制：苏氨酸脱氨酶 苏氨酸α-酮丁酸异亮氨酸反馈抑制其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成(2).分支代谢途径中的反馈抑制：在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在 一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供 应，微生物发展出多种调节方式主要有： 同功酶的调节， 顺序反馈，协同反馈，积累反馈调节等3.2.3 反馈抑制的类型代谢调节与代谢工程(1)同功酶调节——isoenzyme定义：催化相同的生化反应，而酶分子结构有差别的 一组酶 意义：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的 一个较早的反应是由几个同功酶催化时，则分支代 谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑 制作用———某一产物过量仅抑制相应酶活，对 其他产物没影响 举例：大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节代谢调节与代谢工程代谢调节与代谢工程(2)协同反馈抑制定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制 共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式 举例：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum） 多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa） 天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和 苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。

代谢调节与代谢工程天冬氨酸 E,R4-磷酸天冬氨酸E天冬氨酸半醛E,RE 二氢吡啶二羧酸 同型丝氨酸同型丝氨酸磷酸 E,RR O-琥珀酰同型丝氨酸 苏氨酸E,R 六氢吡啶二羧酸 胱硫醚 2-酮丁酸R二氨基庚二酸同型半胱氨酸 R赖氨酸 甲硫氨酸 异亮氨酸天冬氨酸族 （谷氨酸棒 杆菌）代谢调节与代谢工程合作反馈抑制定义：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二 者单独作用之和 举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和 GMP （和IMP）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完 全抑制该酶的活性而二者单独过量时，分别抑制其活性的 70%和10%代谢调节与代谢工程(3)积累反馈抑制定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途 径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制 作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作 用代谢调节与代谢工程Try 16%CTP 14%氨甲酰磷酸 13%AMP 41%……积累反馈抑制——E.coli谷氨酰胺合成酶的调节代谢调节与代谢工程(4) 顺序反馈抑制一种终产物的积累,导致前一中间产物的积累，通过后者反馈 抑制合成途径关键酶的活性，使合成终止。

举例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节代谢调节与代谢工程• 分支途径上游的某个酶受到另一条分支途 径的终产物，甚至于本分支途径几乎不相 关的代谢中间物的抑制或激活，使酶的活 力受到调节，此即代谢互锁 4.1.8 代谢互锁代谢调节与代谢工程在分支合成途径中，分支点后的两种酶竞争同一种底物， 如AMP与GMP，Thr与Lys、Met，由于两种酶对底物的Km值 （即对底物的亲和力）不同，故两条支路的一条优先合成 3.1.8优先合成代谢调节与代谢工程3.2.5避开微生物固有代谢调节，过量生产代谢产物工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢 朝着人们希望的方向进行人工控制代谢的手段：改变微生物遗传特性(遗传学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）；改变细胞膜透性；代谢调节与代谢工程工业发酵的目的——大量地积累人们所需要的微生物代谢产物 在正常生理条件下 微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合 成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和 能量，也不积累中间代谢产物 代谢的人工控制 人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝 着人们希望的方向进行 代谢调节与代谢工程• （1）对于直线式代谢途径：选育营养缺 陷性突变株只能积累中间代谢产物 • • A a B b C c D d E • 1)营养缺陷型菌株的应用末端产物E对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给E ，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制 ），这样才能有利于菌株积累中间产物C 。

1.遗传学方法代谢调节与代谢工程(2) 分支代谢途径：情况较复杂，可利 用营养缺陷性克服协同或累加反馈抑制 积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵 生产中间产物A B CDEF G代谢调节与代谢工程各图成立的条件：1. 限量添加E；2.限量添加E；3. 限量添加E和G；4.限量添加E和G；5.限量添加I“┄”表示营养缺陷突变位置；“≠”表示反馈调节解除要根据其不同反馈控制机制 代谢调节与代谢工程谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产 E：表示反馈抑制；R：表示反馈阻遏 高丝氨酸脱氢酶（HSDH） 天冬氨酸激酶（AK) 赖氨酸生产菌:高丝氨酸缺陷型 代谢调节与代谢工程分支途径——①赖氨酸发酵 (谷氨酸棒杆菌的代谢调控)代谢调节与代谢工程分支途径——②肌苷酸发酵 （IMP合成途径的代谢调控）调控理论的实践应用代谢调节与代谢工程• P124表3-12用营养缺陷型菌株生产的各种氨基酸代谢调节与代谢工程2)抗反馈控制突变株的应用★抗反馈控制突变株——是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株★抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性突变株和营养缺陷性回复突变株中获得。

★获得方法及其原理：代谢调节与代谢工程目标产物结构类似物赖氨酸S-（2氨基乙基）-L半胱 氨酸-(AEC) 苏氨酸-氨基--羟基戊酸（ AHV) 异亮氨酸乙硫氨酸精氨酸D-精氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸代谢调节与代谢工程营养缺陷型回复突变株 调节酶的变构特性是由其结构基因决定的，如果调节 酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性：一是催化亚基和调节亚基的基因均发生突变；另一种可能仅仅是催化亚基发生突变一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平 如果前者发生回复突变，则又有两种可能性另一种是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能营养缺陷型回复突变 代谢调节与代谢工程3)选育组成型突变株和超产突变株如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而 不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成 结构基因不受控制的转录，酶 的生成将不再需要 诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样 的突变株称为 组成型突变株少数情况下，组成 型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种 突变株称为超产突变株代谢调节与代谢工程组成型突变株 结构基因不受控制地转录，酶的 生成将不再需要诱导剂或不再被 末端产物或分解代谢物阻遏。

调节基因发生突变产生无效的阻遏物而不 能与操纵基因结合操纵基因突变突变操纵基因不 能与阻遏物结合组成型突变代谢调节与代谢工程DA B CE F2.生物化学方法1. 添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生(-)(-)(-)2. 添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往 不是该酶的底物，而是底物的衍生物3. 发酵与分离过程耦合：4. 控制发酵的培养基成分：代谢调节与代谢工程3.2.5.2控制细胞膜渗透 性 • 使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制 (1). 用生理学手段—— 直接抑制膜的合成或使膜受缺损 • 如: 在Glu发酵中把生物素浓度控制在亚适量可大量分泌Glu；• 控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性； • 当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法； • 再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是Mn2+； Mn2+的 作用与生物素相似 (2). 利用膜缺损突变株 ——油酸缺陷型、甘油缺陷型 • 如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添 加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸 产量。

• 甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造 成谷氨酸大量渗漏应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或 油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸代谢调节与代谢工程控制细胞膜的通透性生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅 基，该酶催化乙酰CoA的羧化生成丙二酸单酰CoA ，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸 只要控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分， 进而改变膜的通透性，影响到代谢产物的分泌 甘油缺陷型菌株 添加适量的青霉素 油酸缺陷型菌株 代谢调节与代谢工程谷氨酸发酵一、谷氨酸发酵菌种：Corynebacterium pekinenseCorynebacterium glutamicumBrevibacterium flavu二、发酵机理：①谷氨酸以-酮戊二酸为碳架；当以糖质为发酵原料时，合成 途径包括EMP,HMP,TCA循环,乙醛酸循环等；②谷氨酸产生菌的-酮戊二酸氧化酶活力很弱或缺少，而谷氨 酸脱氢酶的活力要很高；③生物素是谷氨酸产生菌必需的一种维生素，在谷氨酸生物合 成中起着重要作用，缺乏或量太高都会使谷氨酸合成受阻生物素通过影响细胞膜的通透性而影响谷氨酸发酵。

代谢调节与代谢工程回补顺序谷氨酸 +NH3谷氨酸脱氢酶-酮戊二酸氧化酶代谢调节与代谢工程1.谷氨酸生产菌中存在2个糖酵解途径EMP/HMP生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变丙酮酸积累乳酸积累2.α-酮戊二酸氧化酶缺失TCA环阻断， α-酮戊二酸积累代谢调节与代谢工程3.四碳二羧酸的来源Δ在生产菌中检出 CO2固定反应酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶 谷氨酸对糖的转化率达到81.7%Δ DCA循环标志酶：异柠檬酸裂解酶在谷氨酸发酵中，DCA环一方面可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充 在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量作用谷氨酸生成期中要封闭DCA环？通过DCA环提供C4二羧酸时谷氨酸对糖的 转化率仅为54.4%代谢调节与代谢工程4.异柠檬酸脱氢酶活力强提供NADPH,用于还原α-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系5.氨的导入合成谷氨酸的反应有3种：α-酮戊二酸 +NH4+NADPH+谷氨酸H2ONADP++谷氨酸脱氢酶α-酮戊二酸 + 天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸转氨酶谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶代谢调节与代谢工程生产菌中谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得重视谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶氨的导入时生物素缺乏， NH4+影响糖代谢速度：提高糖代谢速度高效合成谷氨酸生物素充足时， NH4+不影响糖代谢速度6.谷氨酸合成的调节机制谷aa比天冬aa优先合成谷aa脱氢酶谷aa对其反馈抑制和反馈阻遏柠檬酸合成酶TCA的关键酶，受能荷调节，谷aa反馈阻遏，乌头酸反馈抑制异柠檬酸脱氢酶α-酮戊二酸反馈抑制α-酮戊二酸脱氢酶先天丧失或微弱PEP受天冬aa反馈抑制，受谷aa和天冬 aa反馈阻遏代谢调节与代谢工程7.细胞膜通透性控制代谢调节与代谢工程生物素阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成表面活性剂对生物素有拮抗阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成在对数生长期添加青霉素抑制细胞壁合成细胞膜损伤甘油缺陷型磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成代谢调节与代谢工程三磷酸腺苷(ATP)是为许多反应提供能量的高能磷酸化物,细 胞中的ATP、ADP和AMP含量处于相对平衡的状态——细胞中的 能量状态3.2.5.3能荷（Energy charge） 能。