AB8型大孔吸咐树脂纯化马比木喜树碱工艺研究毕业论文.doc

吉首大学毕业论文吉首大学2011届学士毕业论文 论文题目 AB-8型大孔吸咐树脂纯化马比木喜树碱工艺研究 学生姓名 学号 20074192017 学 院 生物资源与环境科学学院 专业年级 2007级植物科学与技术 指导教师 职称 讲 师 目 录摘 要 3关键词 3Abstracts 3Keywords 31前言 32材料、仪器与试剂 42.1 材料 42.2仪器 42.3试剂 53实验部分 53.1马比木喜树碱的提取 53.2大孔树脂预处理 53.3静态吸咐 53.3.1上样液浓度的选择 5.3.2上样液pH值的选择 53.3.3上样温度的选择 63.3.4洗脱剂的选择 63.3.5洗脱剂浓度的选择 63.4动态吸附实验 63.4.1上样流速的选择 63.4.2树脂吸附量的测定 63.4.3洗脱流速的确定 64. 结果与讨论 74.1上样液浓度对树脂吸附率影响 74.2不同pH值对树脂吸附率的影响 74.3温度对树脂吸附率的影响 84.4洗脱剂对洗脱效果的影响 84.5洗脱剂浓度对洗脱效果的影响 84.6上样流速对树脂吸附的影响 94.7 树脂吸附量的测定 104.8洗脱流速对洗脱效果影响 105结论 11参考文献 12致谢 14AB-8型大孔吸咐树脂纯化马比木喜树碱工艺研究 ( 吉首大学生物资源与环境科学学院 湖南吉首 416000)摘 要：本文采用乙醇溶液常温浸提的方法从马比木中提取喜树碱粗品；并用AB-8大孔吸咐树脂纯化，通过对喜树碱的上样液的浓度、上样pH、上样温度、洗脱剂、洗脱剂浓度的筛选，以及对上样液流速、洗脱剂流速和树脂吸咐量的研究。

结果表明吸附和洗脱的最佳工艺参数为：样液质量浓度 0.300 mg/mL，最佳上样温度为 20℃，最佳上样pH为 4；上样流速 25 BV/H；每克树脂吸咐量为24 mg；以70％乙醇为洗脱剂，洗脱液流速15 BV/H关键词:马比木；喜树碱；大孔吸附树脂；吸咐；洗脱Macroporous Resin Adsorption for purification of Camptothecin Yang Tong Supervisor :ZHAO Dong-liang (College of Biology and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou Hunan, 416000)Abstracts: Camptothecine crude products were gained from Pittosporumli Nothapodytes with ethanol solution in normal temperature. AB-8 macroporous resin was chosen for purification. Through sifting the sample solution concentration, sample pH, sample temperature, elution concentration ,and studying the flow rate for adsorption and desorption, the optimal adsorption and desorption conditions of Pittosporumli Nothapodytes Camptothecine onto AB-8 resin were determined as follows: concentration of sample solution is 0.300 mg/ml, the best sample temperature is 20℃, the best sample pH is 4; flow rate for adsorption 25 BV/H, the resin adsorption of per gram is 24 mg，and the optimal ethanol concentration and flow rate for the desorption of Pittosporumli Nothapodytes Camptothecine were 70% and 15 BV/H.Keywords: Pittosporumli Nothapodytes，Camptothecine，macroporous，adsorption，elut1 前言　 马比木[Nothapodytes pittosporoides (Oliv. ) Sleum. ] ,为茶茱萸科假柴龙属植物，灌木或小乔木，分布于贵州、湖南、湖北、四川等地[1] 。

喜树碱( camp tothecin, CPT)是我国特有树种喜树(Camptotheca acum inata Decne. )中所含有的喹啉类衍生物生物碱, 具有显著的抗癌活性, 目前已有4种以喜树碱为前体合成的喜树碱衍生物获得美国食品和药物管理局(FDA)批准用于临床治疗结肠癌、直肠癌和复发性卵巢癌[2 - 3]1966年Wa11等首次从喜树植物中分离出喜树碱之后，人们对喜树碱的生物和化学性质进行了大量的研究，主要是针对抗肿瘤研究领域目前对其抗癌作用机理的研究已经取得了一定的进展喜树碱的抗癌作用，起初的认为是喜树碱通过抑制核酸合成，导致癌细胞内DNA降解，近年来研究结果否定了这一观点，研究发现喜树碱主要是通过抑制癌细胞DNA复制酶，阻碍癌细胞的增殖1988年又进一步发现喜树碱主要是通过阻断DNA拓扑异构酶I合成，发挥细胞毒性的独特抗癌机理[4]但受喜树碱的自身毒性及其化学特性的影响，其临床应用受到一定限制目前，人们主要是以喜树碱为母体进行化学修饰，来获得具有抗癌活性的衍生物在美国，喜树碱一11 和TPT已经批准用于实体瘤的临床治疗喜树碱已经成为继紫杉醇之后第二个由植物衍生的重要抗癌药物。

近年来，喜树碱在农药领域的应用研究也在逐步深入有研究发现喜树碱能造成家蝇和马尾松毛虫不育，而且对甘蔗黄螟亦有毒杀作用[5]喜树碱自Wall等首次从喜树植物中分离出以来，国内外有关喜树碱提取分离和含量测定的研究已有许多报道[6 -13]，喜树碱的生产也一直是以喜树的种子为原料然而近年来，许多喜树碱生产厂家却改用马比木的根提取制备喜树碱本文以马比木根为原料，乙醇为提取剂，提取喜树碱粗提物; 采用AB-8吸附树脂纯化，探究上样液浓度、上样pH、上样温度、洗脱剂、洗脱剂浓度、上样液流速、洗脱剂流速对纯化效果的影响，确定喜树脂纯化最佳工艺2 材料、仪器与试剂2.1 材料 马比木(经张代贵老师鉴定），AB-8大孔树脂（安微三星树脂科技有限公司），pH试纸，滤纸2.2 仪器UV-160A 紫外可见分光光度计(日本，岛津)，EB-340HW 电子天平(日本，岛津)，DP-32 真空干燥箱(日本，Yamato)，BS-220 恒温水浴锅(日本，岛津)，R-215 旋转蒸发仪(瑞士，步琪)2.3 试剂无水乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇、浓盐酸、氢氧化钠 （以上试剂为国产分析纯）3 实验部分3.1 马比木喜树碱的提取取干燥马比木根粉碎混匀后，过 40 目筛，取一定量粉末置于1000 ml的烧杯中用无水乙醇浸泡 2-3 天后过滤，滤渣再加无水乙醇浸泡 2-3天后过滤，重复 3-4次，合并滤液，得喜树碱提取液[14]。

将喜树碱提取液置于旋转蒸发仪浓缩，温度为 37℃[15] 将浓缩液置于真空干燥箱内干燥至质量不再变化，得喜树碱固体粗提物3.2 大孔树脂预处理大孔吸附树脂先用去离子水浸泡，洗清，再用无水乙醇浸泡24h，蒸馏水洗净，然后用5%HCl浸泡，蒸馏水洗至中性，再用2%NaOH溶液浸泡，用蒸馏水洗至中性，去离子水浸泡备用3.3 静态吸咐3.3.1 上样液浓度的选择分别取0.0109 g、0.0205 g、0.0306 g、0.0403 g、0.0505 g喜树碱粗品，用1 ml甲醇助溶[17]，配成浓度分别为0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml的喜树碱水溶液;将上述溶液分别加入到装有活化AB-8树脂5.00 g 的5 个150 ml 三角瓶中，室温静态吸附24 h，在UV-160A 型紫外分光光度计上于254 nm波长处测量上清液的吸光度，计算树脂对不同浓度的喜树碱溶液吸附率A0－ＡA0吸附率(%)＝ ——————× 100% A0：吸附前吸光值 A：吸附后吸光值3.3.2 上样液pH值的选择分别称取已活化的AB-8湿树脂5.00 g，加入35 ml pH值为4、5、6、7、8、9、10 的喜树碱溶液，室温下静态吸附24 h，在波长 254 nm 处测量其上清液的吸光度，计算吸附率。

3.3.3 上样温度的选择称取5.00 g已活化AB-8湿树脂 6 份，分别加入 40 ml喜树碱溶液，分别在15℃、25℃、25℃、30℃、35℃、40℃温度下静态吸附 24 h，在 254 nm 处测量上清液的吸光度，计算吸附率3.3.4 洗脱剂的选择分别取 5.00 g 已吸附喜树碱的AB-8树脂4份于三角瓶中，分别加入甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇 40 ml，对其在常温下静态洗脱，每30分钟取一次上清液；测洗脱液在254 nm 处的吸光度3.3.5 洗脱剂浓度的选择分别称取 5.00 g 已吸附了喜树碱的AB-8湿树脂8份置于150 ml 三角瓶中，分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液 40 ml，静置 2 h，在波长 254 nm 处测定各上清液的吸光度3.4 动态吸附实验3.4.1上样流速的选择将AB-8树脂浸没在蒸馏水中，按湿法装柱，树脂加到柱体积3/4后，再用蒸馏水反复过柱，装好的树脂柱静止放置过夜，备用取浓度为0.3mg/ml的喜树碱溶液流经AB-8树脂柱脂柱, 流速分别控制为15BV/h、20BV/h、25BV/h、30BV/h，每10ml 收集一管流出液，测定其吸光值A。

3.4.2 树脂吸附量的测定称取湿重为10 g 的AB-8树脂湿法装柱后，用蒸馏水反复过柱，装好的树脂柱静止放置过夜，备用取喜树碱浓度为 0.3 mg/ml、pH为4的上样液在20℃上柱每10 ml收集一管流出液，测定其吸光值A3.4.3洗脱流速的确定取体积分数为70%乙醇溶液洗脱饱和吸附的树脂，流速分别控制为15 BV/h、20 BV/h、25 BV/h、30 BV/h，每10 ml收集一管流出液,测定其吸光值A4. 结果与讨论4.1 上样液浓度对树脂吸附率影响由图1 知：随着喜树碱浓度的升高，树脂吸附率先有一个上升趋势，当浓度到0.3 mg/ml 时较好，随着喜树碱浓度的继续增大，吸附率呈现下降的趋势，故选择浓度为0.3 mg/ml 的喜树碱溶液为最佳上样液 图1 不同喜树碱浓度下的树脂吸附率。