液相色谱柱的应用.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Company Logo,‹#›,液相色谱柱的应用,高效液相色谱培训系列,目 录,一、液相色谱分离原理,二、液相色谱柱的结构,三、液相色谱柱的选择,,四、色谱柱的使用,五、 分析条件的影响,六、色谱柱的维护,一、,,HPLC,分,离原理,样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分在流动相和固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离必要条件),分配过程,分配系数,-,,K,,,,K,=,,K,=,常数,,（,T,恒定）,,,C,m,=,组分在流动相中的浓度,C,s =,组分在固定相中的浓度,,,C,S,C,m,容量因子,k,,,是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数,——,容量因子,(capacity factor),，也称分配比,(partition ratio),，以,k,,表示k,=,M,s /,M,m,M,s,为组分在固定相中的质量，,,M,m,为组分在流动相中的质量,由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子,k,,,,,,,,,样品组分的分离,,,,,液相,色谱的基本流程图,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,流动相,,泵,色谱柱,检测器,,,,,,,,,,,,泵,输,液,分离,,检测,,记录,,,,,,,,,,,,,,,,,A,E,G,B,C,D,F,进样阀,进样,HPG-3x00RS,泵,在整个流速范围下保持,800 bar,高压,最高流速达到,5 ml/min,,WPS-3000RS,自动进样器,进样周期,15,秒,进样阀耐压,1000 bar,,,TCC-3000RS,柱温箱,5-110 °C,温度范围,柱后冷却,,DAD-3000RS,检测器,全波长扫描范围数据采集速率,100 Hz,,,Acclaim,®,2 µm,色谱柱,耐压,800 bar,,Chromeleon,®,CMS,软件及时获得结果,,UltiMate 3000 RSLC,快速分离液相,1/09/2024,13,高性能－,UltiMate 3000 x2,三元梯度系统,有六通道脱气机的溶剂架,独特的双梯度泵：两个三元梯度泵封装在一个机箱内,带温控选项的自动进样器,独特的柱温箱可放置两个柱切换阀,可变波长或二极管矩阵紫外可见光检测器,液相色谱柱的应用,,,,,二、色谱柱的结构和安装,色谱柱的构造,.,色谱柱管,常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。

使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用,50%,的,HNO,3,对柱内壁作钝化处理钝化时使用,HNO,3,在柱管内至少滞留,10min,，以在内壁形成钝化的氧化物涂层色谱柱规格,内径：常用,4.6mm,，,2.1mm,,柱长：常用,50,，,100,，,150,，,250cm,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,色谱柱的构造,,,色谱柱管由柱接头、柱管及滤片组装而成柱接头采用低死体积结构，柱接头两端是螺纹组件连接，中间放置压环用于密封为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用,Φ1.57mm,连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉色谱,柱子的,构造,不同厂家和型号的柱,子会有一定的差别,液相色谱柱的构造,在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片,(,或滤网,),，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀色谱柱的构造,柱填料：,液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。

常用颗粒粒径在,3—10 µm,的范围内      正相柱：多以硅胶为柱填料另一类正相填料是硅胶表面键合,—CN,，,-NH2,等官能团即所谓的键合相硅胶     反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团,(ODS),的非极性填料常用的其他的反相填料还有键合,C8,、,C4,、,C2,、,-NH2,、苯基等液相色谱柱的安装,色谱柱的安装：,,拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂液相色谱柱的安装,按柱管上标示的流动相流向，,(,如条件允许，建议在柱前使用保护柱,),；柱的出口与检测器连接连接管是外径为,1.57mm,、内径为,0.1-0.3mm,的链接管连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧,1,／,4,圈，直至不漏液为止连接接管必须注意：,如果伸出的管线长度过长，可能漏液,,螺母坡度不匹配，密封性差,,死体积区,如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积,色谱连接注意事项,1.尽量减少死体积,,连接管线与接头,,<,0.12,mm,内径管线用于毛细管,HPLC,中<2.1内径色谱柱,0.17,mm,内径管线用于分析型,HPLC,中2.1~4.6内径色谱柱,0.25mm,内径管线用于半制备型,HPLC,中9.4内径色谱柱,0. 5mm,内径管线用于制备型,HPLC,中21.2内径色谱柱,50,,m,L,柱外体积（管线）,,,,,,,,,4,3,2,1,Time (min),0.0 0.5 1.0 1.5 2.0,,10,m,L,柱外体积,,,,,,,,Time (min),0.0 0.5 1.0 1.5 2.0,4,3,2,1,样品:,1. 苯丙胺酸,2. 5-苯基,-3, 6-,二氧-2-哌嗪乙酸,3. Asp-Phe,4.,天冬甜素,色谱柱:,StableBond SB-C18, 4.6 x 30 mm, 3.5 mm,流动相: 85%,H2O with 0.1%,三氟乙酸 : 15%,ACN,流速: 1.0,mL/min,温度: 35°,C,液相色谱柱的应用,,,,,三、液相色谱柱的选择,,分离模式的选择,,,,,,,,,,,,,,,,,样,品,,溶于,有机溶剂,,溶于,水,,溶于四氢呋喃,非离子化,离子化,,溶于,有机溶剂,,溶于,水,,,溶于正己烷,,,溶于甲醇或甲醇/水,或乙腈或乙腈/水,用键合相的反相模式,用键合相的反相模式,低分子凝胶渗透色谱,用键合相的反相模式,抑制电离反相键合相色谱,用硅胶的正相模式,离子交换模式,,,凝胶渗透色谱,凝胶过滤色谱,大孔填料的离子交换模式,用大孔填料的反相模式,,,,,,,,,,分子量,>2,000,分子量,<2,000,,,,,,,,,,低分子凝胶渗透色,用硅胶的正相模式,用键合相的正相模式,,,1.,填料：硅胶,、氧化铝、聚苯乙烯等,,2.,,键合相,：,,C4,、,C8,、,C18,、苯基、氨基等（封端技术）,3.,孔径：,60-100A,分子量,<2000,300A,分子量,>2000,4.,粒径：,2um-10um,5.,内径：,10mm,以下（分析），,10mm,以上（制备）,,6.,长度：,10,、,15,、,25,、,30mm,,柱子的选择,正相 &反相色谱,,正相色谱 20%,反相色谱,80%,正相色谱,极性:固定相 > 流动相,,固定相 - 极性,流动,相(正己烷, 异丙醇)-,非极性,极性物质后出峰,反相色谱,极性:固定相 < 流动相,,固定相 - 非极性,流动相(,甲醇,水,乙腈,,THF,,)- 极性,非极性物质后出峰,,正相色谱,C,B,A,C,B,A,,C,,B,,A,,C,,B,,A,低极性流动相,,,中极性流动相,极性,:,A>B>C,反向色谱法,固定相（非极性）,C18 , C8 , C4 ,,苯基,流动相,(,极性,),Water,MeOH,MeCN,THF,弱酸，弱碱,溶剂极性,各种反相填料的使用比例,反向色谱法,高极性流动相,,,中极性流动相,极性,:,A>B>C,,,A,,B C,,,,,A,,B C,流动相,1. 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：,,H2O＜,甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃,最常用的流动相组成是：“甲醇—,H2O”,和“乙腈—,H2O”，,由于乙腈的毒性大，价格贵，通常优先考虑“甲醇—,H2O”,流动相。

2. 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：,,正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇,最常用的是,正已烷,，,不同混合溶剂的粘度比较,柱填料基质,,,硅胶基质-,pH 2~8,Al,2,O,3,,.,nH,2,O -,pH1~14,,聚合物基质 -,pH1~14,高,pH,下, 硅胶会溶解,低,pH,下, 键合相会断裂,化学修饰困难,孔结构复杂, 孔径不均匀，导致柱效不够高, 有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损,,色谱柱的性能参数,物理性质,硅胶纯度,色谱柱尺寸,颗粒形状,粒径,表面积,孔径,,,,键合类型,碳覆盖率,封端,化学性质,色谱柱的物理性质,硅胶纯度,填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度,色谱柱尺寸,色谱柱子的长度和内径,颗粒形状,球型或不规则型,粒径,平均颗粒直径, 通常3-10µ,m,表面积,颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以,m2/g,表示,孔径,颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300,Å,,硅胶纯度,A,类硅胶,,由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高 (硅羟基的,pKa,低), 导致碱性化合物发生拖尾,,B,类硅胶 (高纯),,由于金属含量低, 硅羟基,pKa,高, 碱性化合物不易发生拖尾,一般金属浓度< 35,ppm); 99.995%,纯度的二氧化硅,,A,型、,B,型硅胶比较,,A,型硅胶,化合物,被吸收,B,型硅胶,峰型峰高,分离正常,金属敏感测试,色谱柱,Diamonsil,（钻石）,C18,5um,，,150 x 4.6mm,流动相,CH3CN / Water (50:50),流速,1.0 mL/min,检测,UV@230nm,硅胶中如果存在金属杂质，将与,2,3-,二羟基萘（峰,2,）形成金属螯合物，保留时间延长并导致峰形拖尾。

2,7-,二羟基萘（峰,1,）不与金属作用并作为内标物色谱柱子的尺寸,色谱柱尺寸,对色谱分离的影响：,,,•,短柱 (15-100,mm) -,运行时间短, 柱压低,,,•,长柱 (150-250,mm),–,运行时间长，分离度高,,,•,窄径柱 (,,2.1,mm) -,检测器灵敏度高,,,•,宽径柱 (3-,23,mm) -,载样量高,颗粒形状与大小,颗粒形状：,1,球形,,2,无定形,球形,粒径 --- 对色谱分离的影响,,,较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5µ,m,粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5µ,m,的粒径,1.8µ,m,,3.5,µ,m,,5,µ,m,,7,µ,m,,10,µ,m,填料粒度,商品化的填料从,2,μ,m ~30,μ,m,目前常用于分析 3,μ,m ,5,μ,m ,10,μ,m,用于半制备 10,μ,m ,15,μ,m,用于制备 15,μ,m ~30,μ,m,,,,,3,μ,m,,填料,粒径的影响,,,,,,,,N,,Flow,3 µ,m,,5,µ,m,10,µ,m,粒径与柱效,,核壳,U-HPLC,的科学原理,美国,Advanced Material Technology Inc. Kirkland,博士发明 。

内核,1.7 um,,因此柱效至少相当于,UPLC;,外层,0.5um,,总粒径,2.7um,,因此色谱柱压力接近,3.0um,色谱柱 流速设定,色谱柱尺寸和填料,粒径的影响,1. C18 4.6*250,5um;242nm,,甲醇,15%→60%(45min),2. C18 4.6*150,3.5um;242nm,,甲醇,15%→60%(25min),3. C18 4.6*50,3.5um;242nm,,甲醇,15%→60%(10min),比表面积与孔径,表面积 --- 对色谱分离的影响,,,高比表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力、柱容量和分离度,.,比表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要,孔径 --- 对色谱分离的影响,,,大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善峰形,,样品,MW,,2, 000,, 选择 100,Å,的孔径,样品,MW > 2, 000,, 选择 300,Å,的孔径,比表面积的比较,比表面积与孔径的影响,大孔径填料适用于大分子分析,大孔径300,Å,全多孔色谱柱,可用于分离蛋白质和多肽,,色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔, 与孔内表面的键合相进行分离分配,300,Å,孔径可改善蛋白质和多肽峰形,,0.20,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,,,300,C18 (300Å),,C18 (80Å),PW 1/2,Leu Enkephalin,M.W. = 556,Angiotensin II(,血管紧张素,II),M.W. = 1046,Insulin B,M.W. = 3, 496,Cyt C,M.W. = 12, 327,Rnase(,核糖核酸酶),M.W. = 13, 684,Lysozyme(,溶菌酶),M.W. = 13, 900,孔径, 分子量对峰宽的影响(梯度分离),选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形,300,Å,孔径可改善大分子的峰形,色谱柱: 4.6,x 150 mm, 5 mm,流动相: 60%,MeOH: 40% 0.1%,三氟乙酸,流速: 0.75,mL/min,温度:,RT,检测器:,UV 282 nm,溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径,窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍,SB-C3 (80Å),300,SB-C3,(300Å),Pw,1/2,= 0.442,Pw,1/2,=0.125,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,O,O,N,HO,HO,CHO,HO,O,H,O,H,O,O,O,O,O,O,O,CH,3,CH,3,,,OCH,3,OCH,3,CH,3,CH,2,CH,2,CH,2,CH,3,CH,3,CH,3,H,3,C,H,3,C,H,3,C,,0 5 10,,,,,Time (min),,,,,,0 5 10,Time (min),Tylosin(,泰乐菌素),MW. 926,分子量虽小但 体积较大的分子,色谱柱化学性质,键合类型,• 单齿键合 - 键合相分子与基体单点相连,• 双齿键合 - 键合相分子与基体多点相连,碳覆盖率,• 与基体物质相连的键合相的量,封端,,• 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来,键合类型,键合类型对色谱分离的影响,,：,,,单齿键合：,提高传质速率, 加快色谱柱平衡,,双齿键合：,增加色谱柱稳定性, 增加色谱柱的载样量,,,CH,CH,CH,CH,CH,CH,O,Si,O,O,O,O,Si,Si,Si,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CH,CH,CH,CH,CH,CH,Si,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,,,,,,,,,,,,,,Si,Si,O,O,,,,,,,,,,,,Si,Si,O,O,,碳载量,,,碳载量是指固定相中碳的含量,不同的键合相有不同的键合密度，并决定固定相的本质。

一般,C18,、,C18,的碳载量为,10%~14%,，高的可达,18%~20%,碳载量,碳载量--- 对色谱分离的影响,,,高碳载量：保留强，提高分辨率,分析时间长,低碳载量：保留弱，缩短运行时间,碳载量,封端技术,封端 --- 对色谱分离的影响,,,封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象,对于极性样品和碱性样品，未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异,固定相键合,二甲基硅烷,,封端,四甲基硅烷,,Si,O,OH,O,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,R = C8,,,C18,,,etc,.,O,OH,OH,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,+,Cl,CH,3,Si,CH,3,CH,3,OH,OH,OH,OH,CH,3,Cl,R,CH,3,(,TMS),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,传统键合及封端技术,,三基封端技术（酰胺基）,PG=,极性酰胺基，,R1=,空间保护的异丙基，,R=,烷基链,柱子稳定性更好，寿命更长,超临界封端技术,传统封端：固,-,液回流封端，封端试剂和催化剂溶于有机溶剂中（甲苯），与键合相在有机溶剂沸腾温度回流数小时至数天不等。

硅胶小孔难到达超临界封端：封端试剂和催化剂由,CO2,超或亚临界流体传递，封端试剂在超或亚临界流体状态下扩散系数是固,-,液回流状态的,1000,倍，能充分扩散到硅胶表面和小孔内部，只需要数小时就可以最大限度封闭活性硅羟基碱灭活测试,色谱柱,Diamonsil,（钻石）,C18,5um,，,250 x 4.6mm,流动相,CH3OH/ H2O (49:51),流速,1.0 mL/min,检测,UV@254nm,如果硅胶表面已经被完全化学改性，乙基苯胺的三个异构体将不会与硅胶发生非极性作用力，所以不会分离并共同洗脱出来封端技术比较,保留值与,pH,的关系,,,,pH,变化值,0.1,,R,S,变化值1.6,,色谱柱：,C18,4.6 X 250mm, 5um,流动相：27%甲醇：73%磷酸,pH 2.5 & 2.6,温度：50,0,C,流速： 1.0,mL/min.,保留值与,pH,的关系,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1,2,3,4,6,7,5,0,1,2,3,4,5,6,Time (min),,,,,,,,0,1,2,3,4,5,,,,,,,,,,,6,1,2,3,4,6,7,5,Time (min),pH 7.00,pH 7.25,色谱柱:,XDB-C8,4.6 x 75 mm, 3.5 µm,流动相: 44% 25,mM,磷酸,,,pH 7.00 : 56%,甲醇,流速: 1.0,mL/min,温度: 25°,C,检测:,UV 250 nm,可电离的组份的分离可能会随,pH,变化发生显著变化,—,甚至很小的 0.05–0.25 个,pH,变化单位.,样品:,ketoprofen,ethyl paraben,Hydrocortisone,fenoprofen,propyl paraben,Propranolol,ibuprofen,0.25 个,pH,,pH,值对保留时间的影响,碱性条件保留时间,随,PH,变化明显，,PH,变化,0.2,，保留时间,变化,1.2min,。

保留时间,随,PH,变化,不明显,酸性条件保,留时间随,PH,变化明显,保留值与,pH,的关系,保留时间,,酸性组份,,中性组份,碱性组份,,,,,复杂组分的流动相,pH,选择技巧,,,,,,色谱柱:,Extend-C18,4.6 x 150 mm, 5 mm,流动相: 30% 缓冲液: 70%,MeOH pH 7,缓冲液20,mM Na,2,HPO,4,pH 11,缓冲液 20,mM TEA,流速: 1.0,mL/min,温度:,RT,检测器:,UV 254 nm,,,,,,,,0 5,1,2, 3,4,5,Time (min),7,6,C18,pH 7,,1.,Maleate,马来酸盐,2.,Scopolamine,东莨菪碱,pKa 7.6,3. PseudoEphedrine,假麻黄碱,pKa 9.8,4. Doxylamine,抗敏安(多西拉敏),pKa 9.2,5. Chlorpheniramine,氯苯吡胺,pKa 9.1,6. Triprol,内径,ine,苯丙烯啶,pKa 6.5,7. Diphenhydramine,苯海拉明,pKa 9.0,,,,C18,pH 11,,,,,0 5 10,1,2,3,4,Time (min),6,5,7,高,pH,下, 碱性成分的保留增加,待测物,pKa,+,1.5,以外的流动相,pH,可保证方法的,稳定性,液相色谱柱的应用,,,,,四、色谱柱的使用,色谱柱的评价,色谱柱的评价,,溶剂前处理,过滤：,0.45um,或,0.22um,孔径滤膜,,目的：除去,流动相和样品,溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。

试剂纯度：采用,“,,HPLC,”,级溶剂,,对试样有适宜的溶解度,,溶剂前处理,脱气,目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的,气泡,气泡对测定的影响：,,1,）柱流量不准,,2,）检测器基线波动,,返回,基线问题分析,液相色谱柱的使用,平衡色谱柱,,反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在甲醇（乙腈）的由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷（正己烷）中的如果需要使用含水的流动相，使用流动相之前用异丙醇过渡液相色谱柱的使用,新色谱柱的平衡方法：,,首先用,0.3ml/min,的流速将色谱柱平衡过夜，然后将流速逐步升高到,1.0ml/min,冲洗,30,分钟，以便将色谱柱的填料充分平衡至最佳状态，这样可以保证色谱柱的使用寿命，并且保证在以后的使用中，获得分析结果的重现性液相色谱柱的使用,日常平衡色谱柱,反相色谱柱使用,10~20,倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线，如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用,90%,甲醇或乙腈过渡 缓冲盐或离子对试剂度需要较长的时间来平衡正相色谱柱在使用,10~20,倍柱体积有机溶剂后用流动相平衡直到基线平稳。

如果需要使用含水的流动相，在使用流动相之前用异丙醇过渡,,色谱柱柱内体积和平衡时间,,,4.6,x 50 0.5 mL 5 min,4.6 x 30 0.3 mL 3 min,4.6 x 15 0.15 mL 1.5 min,4.6 x 150 1.50 mL 15 min,,,,,2.1 x 50 0.10 mL 5 min 60 sec,2.1 x 30 0.06 mL 3 min 36 sec,2.1 x 15 0.03 mL 1.5 min 18 sec,色谱柱尺寸 柱内体积 平衡时间,流速,,(,mm) (Vm) 1.0 mL/min,,色谱柱尺寸 柱内体积 平衡时间,流速,,(,mm) (Vm) 0.2 mL/min 1.0 mL/min,单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间,色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积,÷,流速,液相色谱柱的使用,流动相流速的选择：,,因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。

对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速对内径为,4.6mm,的色谱柱，流速一般选择,1ml,／,min,，对于内径为,4.0mm,柱，流速,0.8ml,／,min,为佳     当选用最佳流速时，分析时间可能延长可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间,(,如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量,),USP,允许调节的色谱条件范围,色谱柱子长度：,70%,色谱柱子内径：,±25%,粒径：可减少,50%,流速：,±50%,柱温：,±10,℃,流动相比例：较小比例的成分,±30%,缓冲盐的浓度：,±10%,流动相,PH,：,±0.5,检测波长：不允许改变,,,,,,,,,,,五、分析条件调整的影响,流动相调整的基本原则（等度）,（,1,）由强到弱： 一般先用,90%,的乙腈,(,或甲醇,)/,水,(,或缓冲溶液,),进行试验， 这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂,(,乙腈或甲醇,),的比例（,2,）三倍规则 ：每减少,10%,的有机溶剂,(,甲醇或乙腈,),的量，保留因子约增加,3,倍，此为三倍规则调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。

（,3,）微调比例：当分离达到一定程度，应将有机溶剂,10%,的改变量调整为,5%,，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变样品溶剂溶解强度的影响,,样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰,色谱柱:,ZORBAX C18, 4.6 x 150 mm, 5 um,流动相: 82%,H,2,O : 18% ACN,检测波长:,215nm,A.,样品溶剂,100% 乙腈,,,,,,,,,0 10,Time (min),1,2,B.,样品溶剂,流动相,,,,,,,,,,,,,,,,,,0 10,Time (min),1,2,样品:,(,安痛片,),1. 咖啡因,2. 水杨酰胺,,,样品溶剂溶解强度的影响,,,0.0,,,,,2.0,,,,,4.0,,,,,6.0,,,,,8.0,,,,,10.0,,,,,12.0,,,,,14.0,,,,,16.0,,,,,18.0,,,,,20.0,,,,,,22.1,,,-10.0,,,,,0.0,,,,,10.0,,,,,20.0,,,,,30.0,,,,,40.0,,,,,50.0,,,,,60.0,min,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,mAU,1 - 2.957,2 - 12.180,3 - 18.067,WVL:254 nm,,戴安,Ultimate 3000,色谱柱：,Dionex acclaim C18,，,250*4.6mm,流动相：磷酸二氢钠,6.0g,，加水,1000ml,，加,三乙胺,1ml,，用氢氧化钠溶液调,PH,至,7.0-,甲醇（,75,：,25,）,检测波长：,254nm,流速：,1.0ml/min,样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：峰前伸和裂分峰,1.,溶剂峰,2. 4-N-,去甲基安乃近,3.,安乃近,溶剂：,100%,甲醇,溶剂：,80%,甲醇,缓冲液对中性物质的影响,色谱柱:,ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 µm,流动相: 44%,A : 56%,甲醇,流速: 1.0,mL/min,温度: 25°,C,检测:,UV 250 nm,含缓冲液的流动相可改善保留, 分离和色谱峰峰形.,A =,水,A =,水+25,mM,磷酸盐缓冲液,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0,1,2,3,4,5,Time (min),1,2,3,4,6,7,5,,,,,,,0,1,2,3,4,,,,,,,,1, 4, 6, 7,2,3,5,Time (min),,1,酮,2,泊金乙酯,3,可的松,4,诺洛芬,5,泊金丙酯,6,普萘洛尔,7,布洛芬,增加缓冲液浓度减少拖尾,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0 2.5 5.0 7.5,Time (min),1,2,3,4,5,6,0 2.5 5.0,Time (min),1,2,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3,4,5,6,色谱柱:,Eclipse XDB-C8,4.6 x 150 mm, 5 um,流动相: 40% 磷酸盐缓冲液 60%,ACN,流速: 1.5,mL/min.,温度: 40,°,C,USP Tf,1.62,1.65,1.63,1.77,1.83,1.12,10,mM,磷酸盐,pH 7.0,USP Tf,1.41,1.50,1.33,1.39,1.36,1.00,,25,mM,磷酸盐,pH 7.0,在中等,pH,下, 离子强度较高, 能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾,随缓冲盐浓度,升高，,Rt,降低,流动相,pH,值的选择,,,,酸性分析物：,pH≤pKa-2,碱性分析物：,pH≥pKa+2,反相,HPLC,常用缓冲液,缓冲液,pKa pH,范围,,磷酸盐,pK1 2.1 1.1~3.1,柠檬酸盐,pK1 3.1 2.1~4.1,甲酸盐 3.8 2.8~ 4.8,柠檬酸盐,pK2 4.7 3.7~5.7,乙酸盐 4.8 3.8~5.8,柠檬酸盐,pK3 5.4 4.4~6.4,磷酸盐,pK2 7.2 6.2~8.2,羟甲基甲胺 8.3 7.3~9.3,氨 9.2 8.2~10.2,硼酸盐 9.2 8.2~10.2,甘氨酸 9.8 8.8~10.8,1-甲基-哌啶 10.3 9.3~11.3,四氢化吡咯 10.5 9.5~11.5,二乙胺 10.5 9.5~11.5,三乙胺 10.7 9.7~11.7,磷酸盐,pK3 12.3 11.3~13.3,,缓冲液的一般,有效缓冲范围,为,PK±1pH,。

三乙胺,对碱性成分峰形的影响,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0 2.5 5.0,Time (min),1,2,3,4,5,色谱柱:,XDB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm,流动相: 85% 25,mM Na,2,HPO,4,: 15% ACN,流速: 1.0,mL/min.,温度: 35,°,C,USP TF 5%,1. 1.29,2. 1.33,3. 1.63,4. 2.35,5. 1.57,No TEA,10,mM TEA,USP TF 5%,1. 1.19,2. 1.18,3. 1.20,4. 1.26,5. 1.14,Time (min),0.0,2.5,5.0,3,,,,5,4,2,1,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,样品:,,1. 去甲麻黄碱,2. 麻黄素,3. 苯丙胺,4.,,脱氧麻黄碱,5. 苯丁胺,酸对酸性组分的峰形的影响,色谱柱:,ZORBAX StableBond SB-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm,流动相: 40%,A: 60% ACN,流速: 1.0,mL/min.,温度: 室温,样品: 异丁苯丙酸，,pKa 4.4,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,pH 3,5 mM NaH,2,PO,4,T,f,= 1.8,pH 3,5 mM NaH,2,PO,4,1%,乙酸,pH 2.5,0.1%,三氟乙酸,T,f,= 1.0,T,f,= 1.09,A:,,乙酸和三氟乙酸均能作为酸性调节剂加至流动相中,,柱容量对峰型的影响,,41.4,mm,overloaded,4.6,mm,overloaded,4.6,mm,,,,,,液相色谱柱:,ZORBAX Eclipse XDB-C18,色谱柱尺寸: 4.6,x 250 mm 5,µ,m,UV: 254 nm,流速: 1,mL/ min.,Uracil,Butylparaben,Naphthalene,Dipropylphthalate,Acenaphthene,,尿嘧啶,尼帕尔金丁酯,萘,二丙基邻苯二甲酸酯,苊,刻度混合: 比例阀,A:,水,B:,甲醇, 用泵抽取50%,B,体积比混合:,V/V,250 mL,水 + 250,mL,甲醇, 用泵抽取100%混合液,定容混合:,250 mL,甲醇, 用水定容至500,mL,, 用泵抽取100%混合液,重量比混合: (,w/w),200 g,甲醇 + 200,g,水, 用泵抽取100%混合液,流动相配比的影响,等度和梯度的影响,色谱柱：,Dionex acclaim C18,，,250*4.6mm,,，,柱温 ：,25,℃,，,波长 ：,203nm,流速 ：,1.0ml/min,样品：人参皂苷,Rg1,1.,等度：乙腈：水（,22,：,78,）为流动相,2.,梯度：乙腈：水为流动相,,0min 20 : 80,20min 40 : 60,,等度和梯度获得柱效不同,柱效,2.1,万,,柱效,6,万,,液相色谱柱的应用,,,,,六、色谱柱的维护,色谱柱的保存,系统及填料,储存溶剂,正相系统(,SiO,2,,CN,NH,2,),正己烷,反相系统,(,C18,C8,C4,C6H6),纯甲醇或纯乙腈,,特殊填料(手性,专用柱),按说明书规定要求,色谱柱的保存,短期不用必须冲洗干净后保存.,长期不用每隔2~3个月冲洗一次,防止碰撞和强烈振动,色谱柱的维护保养,购买新柱后一定要仔细阅读说明书，确认柱的使用条件以及,清洗再生步骤，按照说明书条件测试色谱柱柱效，记录使用压力,􀀩定期检测柱压和柱效,􀀩不同流动相之间转换时应注意溶剂的互溶性,􀀩确认样品不会在流动相中析出或带有固体不溶物，请使用,0.45um,或,0.22um,的一次性滤膜过滤样品，或者进行前处理。

1048617;为了延长色谱柱使用寿命，请使用保护柱1048617;定期用合适的溶剂清洗或再生色谱柱,􀀩长期不用时，清洗干净后，使用柱子说明书中指明的溶剂保,存柱子要从仪器上卸下并用堵头密封后保存1048617;定期用合适的流动相清洗保存的柱子，避免干涸色谱柱易出现的问题,谱图分叉,,,,柱头塌陷?,,,,修补前后现象,1,3,2,1,3,2,样品问题,2,4,3,1,常见问题及解决方法,现 象,原 因,解决办法,峰型不好（分叉、拖尾、前伸）,柱头塌陷、保护柱和柱子不匹配、污染,,见资料,压力升高,管路、保护柱、柱子堵塞,见资料,压力过低,漏液 气泡,见资料,压力波动,气泡,见资料,资料,色谱柱子污染对比,正常 污染后,色谱柱的修复,柱头塌陷修复办法,拧下柱头螺帽(最好在台虎钳上),用尖针轻轻除掉柱头表面的污染填料,取少量与色谱柱相同的新填料,调成浆糊状(正相用正己烷,反相用甲醇),填实柱头(轻轻下压),更换柱头过滤板,将柱头螺帽拧紧,液相色谱柱再生,反相色谱柱,,用以下溶剂至少各25,mL,冲洗色谱柱(分析柱),不含缓冲盐的流动相,100%甲醇,100%乙腈,75%乙腈+25%异丙醇,100%异丙醇,100%二氯甲烷,100%正己烷,100%异丙醇,100%甲醇,,冲洗色谱柱要用比流动相更强的溶剂,,液相色谱柱再生,正相色谱柱,,用以下溶剂至少各50,mL,冲洗色谱柱(分析柱),50%甲醇+50%三氯甲烷,100%乙酸乙酯,Thank You !,。