实验三基因的PCR扩增技术.ppt

实验三实验三基因的基因的PCR扩增技增技术一、实验目的一、实验目的v学习学习PCR反应的基本原理与实验技术反应的基本原理与实验技术v从从BCG基因基因组DNA中中PCR扩增增Rv1791（（PE19）基因）基因二、基本原理二、基本原理vPCR类似于类似于DNA的天然复制过程的天然复制过程v将待扩增的将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两段寡核苷酸片段与其两侧互补的两段寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩扩增倍数可达增倍数可达2n倍 体内DNA的复制DNA聚合酶 dNTP dNTP解旋酶类解旋酶类引物5 5’ ’ 3 3’ ’加热加热变变 性性复复性性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火 PCR扩增原理引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 5’ ’5 5’ ’3 3’ ’3 3’ ’变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火 总体积 25-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1 反应体系三、实验材料三、实验材料vBCG基因基因组DNAv10 PCR反应缓冲液、反应缓冲液、4 dNTPs、、Taq DNA聚合酶、聚合酶、模板模板DNA、引物、引物 （（P1、、P2）、超纯水）、超纯水SWvPCR反应管、移液器、反应管、移液器、 PCR仪、离心机仪、离心机四、实验步骤四、实验步骤v引物设计引物设计v准备准备PCR反应溶液反应溶液vPCR扩增反应扩增反应v结果检测结果检测vRv1791-F： ATGAATTCAGGAAGACAGCATGTCGTTC（EcoR I）vRv1791-R：vATCTCGAGTGTTCCCCCTCTCCTTCAGv（XhoI）（二）准备（二）准备PCR反应溶液反应溶液 10×PCR反应缓冲液反应缓冲液 2.5μl 4×dNTPs 2.0μl 引物引物P1 1μl（（10nM）） 引物引物P2 1μl 模板模板DNA 2μl Taq DNA聚合酶聚合酶 0.2μl 用无菌去离子水至用无菌去离子水至 25μl ↓ 用手指轻弹用手指轻弹PCR反应管管底部，使溶液混匀反应管管底部，使溶液混匀 ↓ 在台式离心机中离心在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底秒以集中溶液于管底 在在PCR仪中设计如下反应程序：仪中设计如下反应程序：94 C、、5min；；94 C、、30sec，，61 C、、40sec，，72 C、、30sec，，30个循环；个循环；72 C、、5min（三）（三）PCR扩增反应扩增反应将已混匀的将已混匀的PCR反应管置于反应管置于PCR仪仪的反应孔中，盖好盖子的反应孔中，盖好盖子进行反应。

反应完毕，将样品取出进行反应反应完毕，将样品取出置于冰浴中待用置于冰浴中待用（四）结果检测（四）结果检测 v本本PCR扩增的产物扩增的产物DNA片段长度为片段长度为300bp，适合于，适合于在在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳检测从每个反应管琼脂糖凝胶中进行电泳检测从每个反应管中取中取5ul PCR产物进行电泳检测产物进行电泳检测 12345循环94℃ 30s56.5℃ 40s72℃ 60s94℃ 30s57.7℃ 40s72℃ 6094℃ 30s58.6℃ 40s72℃ 60s94℃ 30s59.9℃ 40s72℃ 60s94℃ 30s61.1℃ 40s72℃ 60s五、思考题五、思考题v影响影响PCR结果的因素结果的因素。