芬戈莫德调控胶质瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞发挥抗胶质瘤的作用及机制.doc

芬戈莫德调控胶质瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞发挥抗胶质瘤 的作用及机制多形性胶质母细胞瘤 (Glioblastoma multiforme,GBM) 是一种高度浸润、进 展迅速的致死性肿瘤 , 其占据了原发性恶性脑肿瘤的 55.4%,手术切除结合化疗 或放疗是目前的常规治疗手段胶质瘤预后不佳 , 患者两年生存率低于 3%-5%、 中位生存期仅为 14个月, 因此, 亟待寻找新的治疗手段和措施越来越多的证据表明 , 胶质瘤微环境可能与胶质瘤治疗有关 , 因此,调节肿瘤 微环境成为了抗胶质瘤治疗的一个热点胶质瘤微环境由多种细胞组成 , 包括小 胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞等 , 其中小胶质细胞是脑内固有的免疫细胞 , 占据了胶质瘤微环境中浸润细胞的 30%-50%,是调控胶质瘤微环境的关键细胞之 一胶质瘤相关的小胶质细胞和巨噬细胞 (Glioma associated microglia and macrophages,GAMs能被胶质瘤细胞招募至胶质瘤周围并分泌多种生长因子,从 而促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭胶质瘤分泌的 CC家族趋化因子2(C-CMotif chemokine ligand 2,CCL2)、CXC家族趋化因子 12(C-X-C motif chemokine 12,CXCL12)、巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF) 、集落刺激因子 1(Colony stimulating factor 1,CSF-1) 等因子 , 分别作用于GAM上相应的CC家族趋化因子受体2(C-C chemokine receptor type 2,CCR2)、CXC家族趋化因子受体 4(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4) 分化抗原簇 74(Cluster of Differentiation 74,CD74) 和集落刺激因子 1 受体(Colony stimulating factor 1 receptor,CSF-1R), 从而产生招募 GAM并抑制9免疫细胞活性的作用因此，抑制胶质瘤细胞对GAMS勺招募作用是治疗胶质瘤的潜在策略。

相应地, 免疫抑制性微环境则促进GAMS勺免疫抑制及其促肿瘤生长的作用因此，促使GAM趋化为抗胶质瘤生长型也被认为是抗胶质瘤的新策略 芬戈莫德(Fingolimod,FTY720)是由美国食品药品监督管理局(Food and Drug AdminiStration,FDA) 批准的口服治疗多发性硬化症 (multiple ScleroSiS,MS) 的免疫调节剂越来越多的研究表明 , 芬戈莫德对胶质瘤、肺癌、黑色素瘤等多种癌症具有 治疗作用 , 但芬戈莫德抗胶质瘤等的机制目前尚不清楚本文通过制备胶质瘤异 种移植在体模型和胶质瘤细胞和小胶质细胞共培养离体模型 , 研究芬戈莫德对胶 质瘤微环境的调控作用及机制 , 为芬戈莫德治疗胶质瘤提供新的思路和实验依据目的 : 研究、阐明芬戈莫德调控胶质瘤微环境的作用及机制 , 为芬戈莫德的抗 胶质瘤治疗提供实验依据方法 :1. 选取6周龄雄性 WiStar 大鼠,建立异种移植 胶质瘤模型 , 治疗组大鼠腹腔注射芬戈莫德 (2 mg/kg)14 天, 应用核磁共振成像技 术(Magnetic Resonance Imaging,MRI) 和苏木精伊红染色(Hematoxylin and EoSin Staining,H&E Staining) 、评估芬戈莫德对大鼠脑胶质瘤的治疗效应。

2. 应用免疫荧光技术观察脑胶质瘤切片中小胶质细胞的数量和分布情况 ; 观 察脑胶质瘤切片和共培养体系中小胶质细胞的极化情况 3. 通过免疫蛋白印迹 (Western Blot,WB)检测大鼠原代小胶质细胞与C6细胞共培养条件下,芬戈莫德 对小胶质细胞招募相关受体CCR2CD74和CXCR4表达的影响；检测芬戈莫德对小 胶质细胞CXCR下游丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kin ase,MAPK)信号通路的影响4.使用酶联免疫吸附法 (Enzyme Linked Immunosorbent assay,ELISA) 检测细胞上清中CXCL12勺浓度；检测芬戈莫德对细胞培液中小胶质细胞分泌的肿瘤坏死因子 a (Tumor necrosis factor-alpha,TNF- a )、白介素 6(1 nterleukin6,IL-6)、干扰素-y (Interferon- 丫，IFN- 丫)的影响5.通过划痕实验和胶质瘤 细胞侵袭实验观察小胶质细胞对 C6胶质瘤细胞增殖迁移的影响及芬戈莫德的作 用结果:1.芬戈莫德具有抗胶质瘤作用MRI和H&E染色结果显示，芬戈莫德能显 著减小大鼠脑胶质瘤体积,抑制细胞坏死凋亡。

2.芬戈莫德通过内化CXCR4?制 对小胶质细胞的招募作用通过免疫荧光实验发现 , 芬戈莫德可以减少胶质瘤中小 胶质细胞和巨噬细胞的数量 ； 免疫印迹实验检测小胶质细胞招募相关受体 CCR2、CD74和CXCR表达的结果显示,芬戈莫德能够降低CXCR的表达水平；ELISA实验 结果显示,芬戈莫德不影响胶质瘤细胞分泌 CXCL12进一步研究发现,芬戈莫德 使细胞膜上的CXCR水平降低，胞内水平增加，提示芬戈莫德通过内化CXCR抑制 胶质瘤对GAM的趋化作用,从而发挥抗肿瘤效应3. 芬戈莫德抑制CXCR介导的胞内信号通路通过 WB实验对CXCR下游MAPK 通路相关蛋白表达的分析表明,芬戈莫德显著抑制CXCR下游MAP通路的磷酸化 ELISA检测细胞培养上清液中细胞因子 TNF-a、IL-6、IFN- 丫的水平,结果显示 芬戈莫德抑制小胶质细胞 IL-6 的分泌,使其减少约 66%4. 芬戈莫德抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭应用划痕实验和肿瘤侵袭实验发 现, 共培养体系中小胶质细胞促进胶质瘤的迁移和侵袭 ； 芬戈莫德减弱胶质瘤细 胞的迁移和侵袭能力 5. 芬戈莫德促进小胶质细胞由“ M 2”型向“ M 1”型极化免 疫荧光实验显示，在体和离体情况下，芬戈莫德能够减少CD206阳性细胞的数量， 增加i NOS阳性细胞的数量，表明“M2型小胶质细胞减少而“ M1的数量增加, 芬戈莫德可促使小胶质细胞极化为抗肿瘤的“ M1型结论：芬戈莫德通过内化小胶质细胞 CXCR受体、抑制其下游MAPKS号通路 的激活、减少小胶质细胞 IL-6 分泌, 从而抑制胶质瘤细胞对小胶质细胞的招募作 用、调控胶质瘤微环境、抑制胶质瘤的生长。

本文工作的主要创新之处 ：1. 发现 芬戈莫德调控胶质瘤微环境的新作用 , 为芬戈莫德抗胶质瘤的临床应用提供了实 验基础和理论依据2•阐明芬戈莫德通过调节CXCR4-MAPK-IL-6言号通路干扰胶质瘤细胞与小 胶质细胞间的相互交流 , 从而发挥调控胶质瘤微环境作用的机制。