结构生物学导论课件.ppt

电子云密度和结构解析电子云密度和结构解析F(hkl)=V (x,y,z)exp 2i(hx+ky+lz)dxdydzx=0 y=0 z=01 1 1电子密度函数电子密度函数 (xyz)=（1/v）Fhkl exp-2i(hx+ky+lz)h k l Fhkl=|Fhkl|exp(i hkl)Fourier 加和,采用用快速Fourier变换技术 通常在三维晶胞中按 dmin/3 的格点进行计算分析电子密度图 二级、三级、四级结构 结构模型，原子坐标(不包括H原子)0,0yx0.050.05(x,y,z)=(0.05,0.05,0)3245304869472949323128解决相位问题的方法解决相位问题的方法差值差值 Fourier 法法 与已知结构差别很小且同晶分子置换法分子置换法 （MR)有已知相似结构而不同晶 独立位相：单波长反常散射法独立位相：单波长反常散射法(SAD)；多波长反常散射；多波长反常散射法（法（MAD)，多对同晶置换法（，多对同晶置换法（MIR）无已知相似结构直接法直接法 差值差值 Fourier 法法适用于未知结构与已知结构差别很小且同晶时 （如定点突变体、蛋白与小分子的复合物)(xyz)=(1/v)(F未知-F已知)exp-2i(hx+ky+lz)+i已知 h k l 未知结构与已知结构的差异未知结构与已知结构的差异 +缺少原子，缺少原子，-多余原子多余原子 调整模型调整模型 -多余原子多余原子 衍射数据衍射数据 已知结构已知结构|Fo未知未知|-|Fc已知已知|已知结构已知结构 P(xyz)F=fj exp 2i(hxj+kyj+lzj)=|F|exp(i)Step 1temp.scatemp.mtzCCP4程序包中的scalepacktomtz 程序Step 2temp.mtztemp-freeflag.mtzCCP4程序包中的freeflags 程序Step 3phenix.refine known.pdb temp-freeflag.mtzStep 4Coot 程序电子密度图和修正后的原子坐标文件分子置换法分子置换法Molecular replacement(MR)适用于有不同晶的已知相似结构时 如同源蛋白、同一蛋白的不同晶型程序:Phaser,MolRep,Amore,CNS等 分子置换法相角解析原理分子置换法相角解析原理 最符合未知 结构的|Fo|的 搜索模型分子 方位和位置方位和位置 已知结构已知结构搜索模型分子搜索模型分子|Fc|未知结构未知结构衍射数据衍射数据|Fo|旋转函数旋转函数平移函数平移函数 (xyz)未知结构的初始结构模型未知结构的初始结构模型 P氨基酸序列替换Six-dimensional searchlPlace the reference molecule successively at each of the points on a fine gridsampling the asymmetric unit of the target crystal unit cell.lAt each test position,place the reference molecule into all possible orientations,again using a fine grid,creating a set of poses.lFor each pose,generate the symmetry mates of the reference molecule.Thisproduces a possible model for the crystal of the target molecule.lCalculate FR(h)for each potential model,and compare it with FT(h).R=|FR(h)FT(h)|/FT(h)hh P(uvw)=（1/v）|Fhkl|2exp-2i(hu+kv+lw)h k lP(uvw)=(x,y,z)(x+u,y+v,z+w)unit cell交叉旋转函数交叉旋转函数 P(uvw)=（1/v）|Fhkl|2exp-2i(hu+kv+lw)h k l 分子内部的原子间矢量分子内部的原子间矢量自身自身Patterson峰峰 自身Patterson峰分布在围绕原点,半径为相当于分子尺 度的一个体积内 R(C)=P1(X)PM(CX)dV (C为旋转矩阵)交叉旋转函数|Fo(未知)|Fc(已知)|当模型分子旋转到与未知分子方位一致时,P1与PM 达到 最大重叠,R(C)极大,相应的旋转角就是旋转函数的解平移函数平移函数 t 为平移矢量 (三个分量)Fc(已知）Fo(未知)搜索模型分子1,2 间的 交叉Patterson 函数分子间的原子间矢量分子间的原子间矢量交叉交叉Patterson峰峰当旋转后的模型分子平移到与未知分子位置一致时,P1,2(U,T)与P(U)达到最大重叠,T(t)极大,相应的平移矢量就是平移函数的解:Tx,Ty,Tz输入旋转函数的可能正确的几个解,计算平移函数用未知分子和搜索模型分子的结构振幅之间的关联系数作为判据,选取平移函数的解(正确解的关联系数通常明显高于其他解,有时也可能不是最高)搜索模型分子的选择搜索模型分子的选择选择与未知结构相似的已知结构作为搜索模型分子搜索模型分子可以是一个分子,一个寡聚体,一个亚基,一个结构域搜索模型分子中,与未知结构相同的残基保留侧链,不同残基改为Ala(对应于未知分子的Gly的氨基酸残基可改为Gly)搜索模型分子与未知结构进行序列比对,搜索模型分子相对于未知结构的插入残基可删去刚体修正和初始相角的计算刚体修正和初始相角的计算把旋转和平移后的分子作为刚体进行微调,对 Tx,Ty,Tz 进行精修,关联系数提高把搜索模型分子按精修后的 Tx,Ty,Tz进行旋转和 平移,置于未知晶胞中初始相角R因子和电子密度检验:产生未知晶胞中的全部分子,相互间应无重叠 所得初始相角与|Fo|结合,计算3分辨率初始电子密度,主链应 与模型基本吻合 计算 3分辨率的R因子，通常为0.4-0.5 R=|Fo|-|Fc|/|Fo|观测值 计算值初始模型的建立初始模型的建立按未知结构的序列进行氨基酸残基替换精修一轮(3分辨率),R因子降低,电子密度改进基于电子密度,建立初始模型phaser eof MODE MR_AUTO HKLIn test_cad.mtz LABIn F=FP SIGF=SIGFP ENSEmble mol PDB min.pdb IDENtity.99 COMPosition PROTein MW 20000 NUM 2#ck2a SEARch ENSEmble mol NUM 2 ROOT final#not the default END eofPhaser 程序input fileStep 1temp.scatemp.mtzCCP4程序包中的scalepacktomtz 程序Step 2temp.mtzSolve.pdbPhaser 程序Step 4phenix.refine solve.pdb temp-freeflag.mtzStep 5Coot 程序电子密度图和修正后的原子坐标文件Model.pdbStep 3temp.mtztemp-freeflag.mtzCCP4程序包中的freeflags 程序多对同晶置换法多对同晶置换法 Multiple-isomorphous replacement（M I R)制备至少两个同晶的重原子衍生物与母体空间群相同晶胞参数只有微小的差别（0.5-1%)除了在某些位置上增加了重原子外，其他对应的原子位置都相同（不扰乱蛋白分子的构象和晶格堆积）重原子浸泡重原子浸泡用浸泡法浸泡法制备重原子衍生物 实践实践浸泡液组成与晶体生长的槽液相似，含重原子试剂 重原子试剂的种类:如 K2PtCl4 (ClCN,NO3),Pt(NH3)2Cl2,K2AuCl4(ClCN,NO2)(主要与 Met 结合)Hg(OAc)2 (OAc Cl),有机汞化合物 (主要与 Cys结合)Na3IrCl6(Na K,NH4)(主要与 Lys 结合,温和,溶解度高,可用到100mM)UO2(NO3),(NO3 OAc)稀土元素等 浓度（常用0.1-10 mM，可分步浸泡以减少对晶格的破坏）浸泡时间（hrs-days)(首次实验可试1mM,1天)要求：同晶度好结合位点少占有率高差值差值 Patterson 函数函数生物大分子:Patterson 函数不能直接反映重原子位置母体衍射数据 IP|FP|重原子衍生物衍射数据 IPH|FPH|计算差值 Patterson 函数，解出重原子位置 P(uvw)=（1/v）(|FPH|-|FP|)2exp-2i(hu+kv+lw)h k l 差值 Patterson 峰代表重原子间矢量重原子间矢量 重原子位置 计算计算FH重原子位置的精修（如用最小二乘法）计算重原子对结构因子的贡献 FH NF(hkl)=Kqj fj exp2 i(hxj+kyj+lzj)-Bj(Sin/)2 j=1 只对重原子加和 FH,H矢量三角形矢量三角形 FPH=FP+FH 复数加和(矢量加和)至少用两个重原子衍生物才可唯一确定相角至少用两个重原子衍生物才可唯一确定相角已知已知|FP|FPH|FH多对同晶置换相角解析步骤多对同晶置换相角解析步骤1.生长母体晶体2.采集母体衍射数据(包括初步晶体学研究)3.制备重原子衍生物,X-衍射实验初步鉴定晶体衍射情况4.初步采集重原子衍生物数据 5.衍射数据分析(计算同晶差值|F|iso,初步判断重原子衍生物是否合用)6.改进重原子衍生物,重复3-57.找到合用的重原子衍生物后，采集重原子衍生物的精确衍射数据(包含反常散射数据)7.求解相角(包括差值Patterson计算和分析,重原子位置精修,搜寻次要位置，原点统一,手性确定)8.电子密度改善和解释,获得部分结构信息单波长反常散射法单波长反常散射法Single wavelength anomalous dispersive method(SAD)Friedels lawFh=Fh(cos+isin)=A+iBF-h=F-h cos(-)+isin(-)=A-iBIh Fh2=(A+iB)(A+iB)=A2+B2I-h F-h2=(A-iB)(A-iB)=A2+B2h=-hFhF-hh-hBreakdown of Friedels law fj=f0+f+i fSIRAS phasingSAD phasing单波长反常散射相角解析步骤单波长反常散射相角解析步骤1.生长母体晶体2.采集母体衍射数据(包括初步晶体学研究)3.制备重原子衍生物,X-衍射实验初步鉴定晶体衍射情况 制备硒代蛋白质晶体。

4.初步采集重原子衍生物数据 5.衍射数据分析(计算同晶差值|F|iso,初步判断重原子衍生物是否合用)6.改进重原子衍生物,重复3-57.找到合用的重原子衍生物后8.采集重原子衍生物的精确衍射数据(包含反常散射数据)9.求解相角(包括差值Patterson计算和分析,重原子位置精修,搜寻次要位置，原点统一,手性确定)10.电子密度改善和解释,获得部分结构信息Step 1temp.sca重原子坐标hkl2map程序Step 2temp.scaResolve_1.mtzSolve in Phenix Step 4phenix.refine start.pdb resolve_1.mtzStep 5Coot 程序电子密度图和修正后的原子坐标文件Step 3Resolve_1.mtzStart.pdbResolve in Phenix重原子坐标Protein.seq。