蛋白酶活力的测定.docx
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1蛋白酶活力的测定1.1原理采用福林-酚试剂法福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和 钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质 及其水解产物呈上述反应因此可利用此原理测定蛋白酶活力通常以酪蛋白为底物， 在-定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤 除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的 深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测 定，从而计算出蛋白酶的活力1.2试剂1.2.1福林-酚试剂向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及 700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸lOOmL，充分混合后，接上回 流冷凝管，以文火回流10h ,结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及 数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色， 需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂 瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。
此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释1.2.20.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液 精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL1.2.30.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定 容至 1000mL1.2.4pH 值3~6醋酸缓冲液精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀 释定容至1000mL1.2.52%酪蛋白底物缓冲液1.2.5.1测试酸性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL（用去离子水配制），在水浴中加热溶解撚后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL当日配用或置于冰箱中保存1.2.5.2测试中性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，置于1000mL三角瓶中，加入 0.2mol/LNa2HPO4溶液（去离子水配制）610mL，在沸水浴中搅拌使其溶解，冷却后过滤， 加入 0.2mol/LNa2HPO4溶液（去离子水配制）390mL，用去离子水定容至1000mL，即成pH7.0、 2%酪蛋白溶液当天配用或置于冰箱中保存1.2.6100 jug/mL酪氨酸溶液精确称取100mg酪氨酸逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后用去离于水定容至100mL 放入冰箱中保存，临用时用去离子水稀释10倍。
1.3 操作步骤1.3.1酪氨酸标准曲线的绘制取18支试管分成6组（每组3支，平行样），编号，按表1分别加入标准酪氨酸、 去离子水、O.4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40弋水浴保温20min , 然后在721型分光光度计上进行比色创定（波长660nm），以浓度为O jug/mL酪氨酸反 位液做空白对照'1.3.2样品酶活的测定精确称取酶粉5g，充分碾细，加去离子水100mL，在40弋水浴中搅拌30min，充 分溶出酶蛋白，然后过滤，留滤液待测取4支试管编号（1号为空白对照），分别加入 酶液1mL,1号管立即加入O.4mol/LTCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入ImLpH7.0、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液（如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物 缓冲液），迅速混匀，并立即放入40弋恒温水浴准确计时，保温1Omin后，立即加入 0.4mol/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓 冲液，摇匀，继续置于水浴中保温2Omin，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白 沉淀物，然后取各试管滤液1mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4mol/L碳酸钠溶 液5nL和己稀释的福林-酚试剂1mL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定（波长 66Onm）。
对照标准曲线，计算酪氨酸含量管号标准酪氨酸去离子水Na2CO3福林一酚试剂酪氨酸含量wffiuo寸 口 些 oz69.mHd)«Hd 骰—wcx骰iHfesOIM- WEOI 回片菽必01 -粽処 iss乏SEI田岳悭怛必尼0丈O_、NX 寸 x< G 典8BMM去典SOIM oomoo.I-19O8IS0.O8.OS09席寸.09.0寸寸 IS9.0 寸.omO0IS8.O0.O0oisom(」E、6ri )(-IE)(-IE)(<_OE17.0)(-IE)(-IE)(-IE、6riooI-l)。
