基因工程题库-.pdf

名词解释：断裂基因 :有些真核蛋白质编码基因的核苷酸序列中间插有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段，我们称这种编码序列不连续的基因为断裂基因内含子（ intron) ：指真核生物基因中不能翻译成蛋白质的DNA 片段，但可被转录当外显子转录的RNA 被剪接在一起时，就将内含子转录的RNA 从整个转录物中除去内含子不是一成不变的，具有相对性外显子 （extron)：外显子是指能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段，一个基因可有多个外显子重叠基因是指同一段DNA 的编码顺序，由于阅读的框架不同或终止早晚的不同而可同时编码两个以上多肽的现象一般常见于原核生物启动子：启动子是位于结构基因5’ 端上游的一段DNA 序列，能够与RNA 聚合酶结合，启动基因的转录SD 序列：在原核生物中，mRNA 中与核糖体16s rRNA 结合的、一段富含嘌呤的核苷酸序列称为 SD 序列，位于mRNA5’ 端，一般位于mRNA 的起始密码子AUG 上游 5-10 个碱基处，并同16s rRNA 的 3’ 端互补帮助从起始AUG 处开始翻译终止子 (terminator ) ：是给予 RNA 聚合酶转录终止信号的DNA 序列。

复制子 (replicon ) ：DNA 中能独立复制的单位称为复制子复制的起始位点称复制原点，复制的终点称复制终点限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp） ，并由此处切割DNA 双链的核酸内切酶同序同切酶（完全同裂酶）： 识别位点和切点完全相同同序异切酶（不完全同裂酶）：识别位点相同，但切点不同同尾酶 (Isocaudamers）识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶切口酶：只切割双链DNA 中的一条链，造成一个切口的一类特殊的Ⅱ型限制性内切酶移动切割：在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA 双链位点偏爱： 限制酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率，这种现象称位点偏爱星号（ *）活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星号活性核酸探针：能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子载体 (vector) :将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞的工具称为载体质粒（ plasmid） ：是独立于染色体以外的能自主复制的双链、共价、闭合、环状DNA 分子存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。

质粒的空间构型：共价闭合环状DNA （cccDNA) 克隆载体（ cloning vector ） ：主要用于扩增或保存DNA 片断其上有复制子即可；表达载体（ expression vector） ：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体这类载体既有复制子，更要有强启动子；穿梭载体（ shuttle vector） ：装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达插入失活：这种在一个基因位点中插入外源DNA 片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活α-互补：是指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）基因的突变体之间实现互补插入型载体：通过特定的酶切位点允许外源DNA 片断插入的载体（0-11kb) 置换型载体：允许外源DNA 片断替换非必需DNA 片断的载体 (9-23kb) 人工染色体载体又叫大分子DNA 克隆载体，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA 片段复制的载体整合载体含有一段便于同源重组的DNA 序列，利于外源基因的整合插入到染色体中去的载体。

基因敲除（ gene knock out） ：是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计，通过同源重组使该基因失去功能，然后从整体观察实验个体，推测相应基因的功能的一种技术突变体库：是指标记基因在载体的携带下，通过DNA 重组事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA 或 RNA ） ，在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程Southern 杂交：即DNA-DNA杂交分析，检测样品中特定的DNA 及其含量是一种检测DNA 分子的一种方法， 通过 southern 印迹转移将琼脂糖凝胶上的DNA 分子转移到硝酸纤维素滤膜上，然后进行分子杂交，在滤膜上找到与核酸探针有同源序列的DNA 分子Northern 杂交：即 RNA-DNA杂交分析 检测样品中是否含有特定基因的转录产物（mRNA ）及其含量Western 杂交：即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质印迹转移（ blotting) ：通过电泳将DNA 、RNA 或蛋白质样品进行分离，使不同相对分子质量的的分子在凝胶上展开，然后将凝胶上的样品通过影印的方式转移到滤膜上的过程称为印迹。

探针：分子杂交中被标记的已知序列的核酸片断称为探针菌落杂交：就是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA 释放出来，并使之固定在滤膜上然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DNA 菌落杂交主要用来从用质粒或Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆斑点杂交：是分子杂交中最简单的一种，直接将DNA 或 RNA 分子以斑点的形式固定在杂交滤膜上，然后进行分子杂交芯片实验室：在微小的硅材料表面，制造出能够对微量样品进行变性、分离、纯化、电泳、PCR 扩增、加样及检测等微小结构，使过去一个实验的各个实验步骤微缩于一个芯片上，这种技术被称为芯片实验室RNA 干扰 ( RNA interference, RNAi) ：是指在生物体细胞内，由于外源或内源性双链RNA的存在，诱导体内同源mRNA 高效特异性降解的现象PCR 技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内DNA 复制的方式，在体外选择性地将DNA 某个特殊区域扩增出来的技术染色体步查（移） （chromosome walking ） ：是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步获得与其相邻的未知序列的核苷酸组成的方法和过程。

直接进化或定向进化：对目的基因人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力， 将满足要求的、 适合特定目的的分子筛选出来，从而实现在试管中分子水平的模拟进化DNA shuffling 是指 DNA 分子的体外重组,是基因在分子水平上进行有性重组通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能基因文库（ gene library)： 某个生物的基因组DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库文库的代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA 片段可以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任何一段基因组DNA 均一化 cDNA 文库：通过一定的策略和方法，将构建好的独立cDNA 文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度基因在cDNA 文库中的比例，从而使高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致，这种cDNA 文库称均一化cDNA 文库多态性：人的DNA 序列上平均每几百个碱基会出现一些变异（variation ） ，并按照孟德尔遗传规律由亲代传给子代，从而在不同个体间表现出不同，因而被称为多态性 （Polymorphism ） 。

判断填空选择内含子是相对的，一个基因的内含子可能是另一个基因的外显子(如大鼠的肌钙蛋白基因）内含子的生物学意义：（1）有利于储存较多的遗传信息，（2）有利于变异和进化, （3）有的内含子可编码内切酶4）调控（5）提高进化速率由于在内含子的存在在保留原有蛋白的同时，可产生一种新的蛋白，具有进化优势细菌、病毒、线粒体的DNA 分子都是作为一个复制子完成复制的；真核生物的基因组可以同时在多个复制起始位点上开始双向复制，因此含有多个复制子基因工程（ genetic engineering): 狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接，然后转入另一种生物体（受体）内， 使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状又称DNA 重组技术广义上讲，基因工程是指重组DNA 技术的产业化设计与应用， 包括上游技术和下游技术两大组成部分上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术） ；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程DNA 双链上的回文对称序列（旋转对称序列，反向重复序列），一般长4-6bp 影响限制性内切酶活性的因素：1. DNA 的纯度一般采取①纯化DNA ②加大酶的用量③延长保温时间④ 扩大反应体积（>20l）2. DNA 的甲基化程度（基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。

3. 温度（不同的限制性内切酶的最适反应温度不同大多数是37 度，少数要求40-65 度 ）缓冲液 (Buffer) 是影响限制酶活性的重要因素商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液甲基化酶功能：保护宿主DNA 不被相应的限制酶切割如果限制性内切酶的识别位点是从表达Dam 或 Dcm 甲基化酶的菌株中分离而得，并且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠，那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能不被切割基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株常用的 DNA 聚合酶的特点1. 共同特点：把dNTPs 连续地加到引物的3’— OH 端 2. 主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同T7 DNA 聚合酶可以连续添加数千个dNTPs 而不从模板上掉下来其它几种DNA 聚合酶只能连续添加10 多个 dNTPs 就会从模板上解离下来大肠杆菌DNA 聚合酶 I 的性质：①一条单链多肽②53’ DNA 聚合酶活性③5’3’外切酶活性④53’外切酶活性位于N 端 ⑤用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N 端的 53’外切酶活性部分就成为Klenow fragment 2）DNA 聚合酶 I（Pol I）的反应条件：①底物： dNTPs（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP）② Mg2+ ③ 带有 3’— OH 游离端的引物④DNA 模板T4 DNA 聚合酶：从 T4 噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。

由噬菌体基因43 编码有 5’3’ 聚合酶活性和3’5’ 外切酶活性（约为Klenow 片段活性的200 倍） 当没有 dNTP 时， T4DNA 聚合酶行使3’5’ 外切酶功能，制造出3’ 隐蔽端如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP 的位置T4 DNA 聚合酶的用途①补平 3’ 隐蔽末端② DNA 3 ’ 末端标记标记末端（取代合成法）用35’外切酶活性作用于所有末端（平端、3’隐蔽端、 5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端再利用它的53’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP载体应具备的特征：1.在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）2.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，供外源DNA 片断插入，同时不影响复制3.有一定的选择标记，用于筛选4.具有较高的拷贝数，便于载体的制备标记基因用途：1.选择标记基因：鉴别目的DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来2.筛选标记基因：用于将携带了外源DNA 片断的重组子挑选出来λ噬菌体由外壳包装蛋白和DNA 组成λ噬菌体感染大肠杆菌后，通过同源重组，将其DNA 整合到宿主细胞的染色体DNA 上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种状态称为溶原状态，这个过程称溶原化。

可以与 dNTP 连接成地高辛-dUTP 等，参入 DNA 合成过程形成地高辛标记的DNA 探针地高辛的结合物是抗地高辛抗体用非放射性标记的探针检测原理：探针DNA 用生物素或地高辛标记亲和素或地高辛抗体与酶偶联酶催化一个发光或显色反应亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合核酸探针杂交筛选法的缺点是：只检测是否有外源DNA 插入，而不论该DNA 是否表达出产物耐热 DNA 聚合酶：指在高温下具有活性的DNA 聚合酶，主要用于PCR 反应逆转录酶：依赖RNA 的 DNA 聚合酶（ RNA 指导的 DNA 聚合酶）末端转移酶：来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA 聚合酶可在cDNA 或载体的3’ 末端加同聚物尾巴，便于克隆大肠杆菌连接酶只能连接粘性末端T4 噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端连接反应的温度：连接酶反应的最佳温度是37 C在 37℃下粘性末端的结合很不稳定，所以一般采用4~16 C插入片段与载体的浓度比例：10~20 倍增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象反应温度一般14~16℃提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10 倍大于粘性末端的连接）；加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会；加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用；加入单价阳离子（NaCl） ，最终浓度150-200 mM 染色体复制和遗传的三个基本组件：（1）自主复制序列（ARS ） （ autonomous replicating sequence ）DNA 复制起始点（ ori） （2）着丝粒（ centromere，cen） （ 3）端粒（ telomeres，tel）生物芯片微阵列的制作按照制作方法可分为两大类，即原位合成和预合成后点样。

平台效应 （plateau effect） ： PCR 扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底将 DNA 大片段切割成小片段的三种方法：限制性内切酶酶切；超声波处理； DNA 酶 I 降解(加 Mn2+) 基因组文库与cDNA 文库最大的区别在于cDNA 文库具有时空特异性构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因构建 cDNA 文库时最好选取目的基因表达量最高的发育时期或这一时期的特殊组织cDNA 文库的构建：第一，细胞总RNA 的提取和mRNA 分离；第二，第一链cDNA 合成；第三，第二链cDNA 合成；第四，双链cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖重组率= 含有外源 DNA 的重组分子数/ 载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA 重组的后续操作简答基因工程操作的主要操作内容1）目的基因的获取2）重组体的制备3）重组体的转化4）克隆鉴定5）目的基因表达放射性标记的优缺点：优点：制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。

缺点：半衰期短（32P 只有 14.3 天） 、 不易保存、对人体有害要求在专门实验室操作质粒的基本性质：质粒的自主复制性：质粒能利用寄主细胞的DNA 复制系统进行自主复制质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成的群体不相容性群质粒的可转移性：在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒:非接合型质粒值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA 转移，这个过程由bom 和 mob 基因决定基因芯片： 又称DNA 芯片或 DNA 阵列，是生物芯片的一种类型，它是将DNA 分子固定于支持物上， 并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中mRNA 的表达量也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定基因芯片分析的过程主要包括：样品及其标记处理、芯片制作、分子杂交、信号的检测和数据处理及分析等基因芯片技术的特点高通量、 微型化： 基因芯片技术的特点的核心是微型化芯片每平方厘米固体表面上可固定十万个DNA 片段、数万个基因一次分析可得到数万个基因的表达信息。

微型化的另一方面是样品用量与试剂用量的微量化，用纳克级的mRNA 、 微升级的杂交液就能分析成千上万个基因的表达信息平行化： 基因芯片技术可在同一张芯片上同时对实验组和对照材料进行杂交分析，实现了平行化操作，避免了各种误差，提高了信息的重现性和准确性，使实验结果具有可比性自动化：芯片制作及分析过程易于自动化芯片设计制作可实现自动化，可根据要求将需要分析的基因制作成符合要求的芯片；杂交、 洗片等过程都可实现自动化，工作效率大幅提高基因芯片的应用1．基因表达分析；2．基因型及多态性分析；3．杂交测序；4．核酸和蛋白质相互作用的研究；5．疾病的诊断与治疗；6．药物开发；7．在营养与食品卫生领域的应用；8．在环境科学领域中的应用RNAi 诱导特异性基因沉默的机制研究（1） dsRNA 的降解， siRNA 的形成dsRNA 进入细胞内 , 与一种核酸内切酶Dicer 结合 , 并被酶切成19 ～ 23nt 的小干扰RNA( small interference RNA, siRNA) , （2 ）沉默复合物的形成siRNA 与多种蛋白结合组装成无活性的蛋白复合体3）沉默复合物的激活在 ATP 的作用下 ,无活性的蛋白复合体形成具有活性的RNA 沉默复合物 ( RNA- induced silencing complex, RISC) （4）mRNA 的降解RISC 具有解螺旋酶的功能, 使与其结合的siRNA 双链解螺旋成单链, 释放正义链 ,保留反义链 ,随后识别并结合细胞内与其反义链相互补的mRNA链。

RISC 将 mRNA 剪切成 siRNA 双链 , 降解 mRMA, 使靶基因表达沉默RNA 干扰诱导特异性基因沉默的特点(1)诱导物为双链RNA (dsRNA) , (2)高效性极少量的dsRNA 进入细胞内就可引起细胞内靶序列的高度的表达沉默, (3)高特异性一种 siRNA 分子只对与其反义链特异性互补的 mRNA 起降解作用 , (4)可传递性RNAi 的效应可在生物体内不同的细胞之间传递, 甚至可随细胞的分裂而传给子代细胞 , 使子代细胞同样具有对靶基因沉默的效应鸟枪测序法 (shotgun sequencing)：随机克隆测序将待测的DNA片段随机打断并构建随机重叠克隆文库，然后通过通用引物测定每个克隆中的待测DNA 序列当这些已测序列的数量达到一定程度后，相当于待测DNA 片断的每一部位的序列也就被测定出来了，通过这些所测序列之间的重叠部分，最终可将整个DNA片断的序列拼接出来，这样的测序策略称为随机克隆测序完整基因组的测序过程一般包括三个步骤：（1）建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC （ Yeast Artificial Chromosome ）克隆、细菌人工染色体BAC （Bacterial Artificial Chromosome ）克隆等；（2）利用鸟枪法（Shotgun Strategy）测定每个克隆的序列；（3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。

基因直接进化的用途提高酶活性；改变底物特异性；改善酶的稳定性；获取具有新功能的酶；提高药用蛋白和疫苗的活性；改善整个代谢途径基因组DNA 文库的构建程序包含5 个部分：① 载体的制备载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好② 高纯度大分子量基因组DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection） ；④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤ 重组克隆的挑取和保存基因组 DNA 文库与 cDNA 文库的比较1）cDNA 文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA 文库，并且受细胞来源或发育时期的影响2）cDNA 文库虽能反映mRNA 的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息3）在 cDNA 文库中，相应于高丰度mRNA 的 cDNA 克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA 的 cDNA 克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难论述或实验设计设计一个证明DNA 是遗传物质的实验。

PCR 克隆和一般DNA 片段的克隆有何异同Southern 杂交主要步骤：（1）待测 DNA 样品的制备、酶切（2）待测 DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳（3）凝胶中DNA 的变性：碱变性（4）Southern 转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法（5）探针的制备（6）Southern 杂交 (预杂交、杂交）预杂交的意义：将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附7）洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去8）杂交结果的检测PCR 技术的基本原理和过程在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板 DNA, 四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶 , 一对合成DNA的引物 ,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30 次循环 ,最终使基因放大了数百万倍 ; 扩增了特异区段的DNA 带PCR 反应过程：①94℃变性②50-65℃退火③ 72℃延伸1）复性和延伸温度复性的温度是PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃ 之间具体的温度主要由引物的Tm 值决定（低于Tm 值 2-3 ℃ ） 。

延伸温度绝大多数设定为72℃ 如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR 2）反应时间变性一般使用30 秒钟，如果模板的G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长复性时间有30 秒种一般是足够的延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb 用 1 分钟来保证充足的时间3）循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为25～35 次双脱氧末端终止测序法的基本原理和过程原理是：采用核苷酸链终止剂—2， ，3，-双脱氧核苷酸终止DNA 的延长由于它缺少形成3/5/磷酸二脂键所需要的3-OH，一旦参入到DNA 链中，此DNA 链就不能进一步延长根据碱基配对原则，每当DNA 聚合酶需要dNMP 参入到正常延长的DNA 链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止；二是参入dNTP,使 DNA 链仍可继续延长，直至参入下一个ddNTP根据这一方法，就可得到一组以ddNTP 结尾的长短不一的 DNA 片段方法是：分成四组分别为ddAMP 、ddGMP、ddCMP、ddTMP 反应后，聚丙烯酰胺凝胶电泳按泳带可读出DNA 序列。