普通烟草NtNAC055基因的克隆、鉴定及表达分析.docx

普通烟草NtNAC055基因的克隆、鉴定及表达分析 王奇 李晓旭 郭存 郭永峰摘要：NAC家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育以及应对环境胁迫中起着至关重要的作用，克隆和验证烟草中NAC相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据本研究采用RT-PCR方法从普通烟草K326根部cDNA中克隆到NtNAC055基因，对NtNAC055及其编码蛋白进行了生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位和转录激活等相关试验结果发现，NtNAC055基因的CDS序列全长为1032 bp，NtNAC055蛋白具有典型的NAC结构域，编码一个具有343个氨基酸的NAC转录因子;通过进化分析发现，烟草NtNAC055与拟南芥ANAC055同源性较高，同属于RD26亚家族;通过亚细胞定位分析以及转录激活分析发现，NtNAC055蛋白在细胞核中且具有转录激活活性;运用qRT-PCR技术，对该基因不同组织和胁迫处理后的表达进行了分析，结果显示，NtNAC055基因在根、茎、叶、花和腋芽中均有表达，且在根部表达量最高;同时，该基因受干旱和热胁迫的诱导，表明烟草NtNAC055基因可能参与了烟草的非生物胁迫应答反应。

关键词：烟草;NtNAC055;非生物胁迫;干旱;基因表达Abstract： NAC family is one of the largest transcription factor families in plants， and plays a significant regulatory role in plant development， signal transduction and abiotic stress response. Cloning and validation of NAC related genes in tobacco can provide a theoretical basis for tobacco breeding for stress tolerance. In this study， NtNAC055 was cloned from root cDNA of cv. K326 by RT-PCR. In addition， bioinformatics analysis， expression pattern analysis， subcellular localization and transactivation activity analysis of NtNAC055 were performed. The results showed that the full-length of NtNAC055 was 1032 bp， and the NtNAC055 protein was 343 aa that contained a typical NAC domain. Phylogenetic analysis indicated that NtNAC055 had high homology with ANAC055 from Arabidopsis. Subcellular localization and transactivation analyses showed that NtNAC055 was localized in the nucleus and had transactivation activities. The expressions of NtNAC055 were analyzed by qRT-PCR in different tissues of tobacco， and in seedlings under different abiotic stresses. The results showed that NtNAC055 was expressed in tobacco roots， stems， leaves， flowers and axillary buds， especially in roots. The expression levels of NtNAC055 were induced under drought and heat stresses， which indicated that NtNAC055 might be involved in tobacco abiotic stress responses.Keywords： tobacco; NtNAC055; abiotic stress; drought; gene expressionNAC（NAM， AFAT， CUC）转录因子是植物特有的一类转录因子[1]，SOUER等[2]从矮牵牛中克隆到第一个NAC转录因子NAM（No Apical Meristem），该转录因子家族成员作为重要的调控因子广泛参与了植物生长发育过程，包括叶片衰老[3-4]，侧根发育[5-7]，果实成熟[8]，次生壁形成[9-10]和植物激素信号转导[11-13]等。

同时，有很多文献报道NAC转录因子家族成员在植物响应非生物胁迫中也发挥着重要的作用[14]过表达ANAC072、ANAC019和ANAC055基因时，转基因拟南芥植株的耐旱性显著提高[15]，并可以促进拟南芥干旱应答基因的表达ANAC072可被多种生物、非生物胁迫诱导表达，包括脱落酸（ABA），NaCl，干旱，茉莉酸（JA）等[15-18]在豆科植物中间锦鸡儿中，过表达ANAC055的同源基因CiNAC4提高了转基因植株的耐盐性[19]在玉米中，ZmNAC55基因在干旱、盐等非生物胁迫处理下被显著诱导，且过表达ZmNAC55的拟南芥植株对干旱的抗性明显增强[20]在水稻中，过表达OsNAC9基因可以有效提高转基因水稻植株的耐旱性[21]沙冬青在干旱、盐、低温和高温胁迫以及施加外源ABA的条件下，AmNAC3、AmNAC4、AmNAC5的表达量均可被诱导上调将3个基因分别转入到拟南芥中，AmNAC3过表达株系的耐盐性得到显著提高，AmNAC4和AmNAC5基因可以提高耐盐性和抗旱性[22]烟草在不同的非生物胁迫和植物激素处理下，NtNAC072基因的表达可被NaCl、干旱以及ABA显著诱导，说明NtNAC072基因可能在烟草处于干旱胁迫和盐胁迫等非生物逆境下起着重要的作用[23]。

徐小艳等[24]將NtNAC1基因转入野生型烟草植株中，在使用甘露醇模拟干旱条件下，其过表达株系根长较野生型长，证实了NtNAC1基因具有增强植株抗旱性的功能代婷婷等[25]将NtNAC4基因转入普通烟草中，在干旱处理下，转基因烟草幼苗根长与对照相比没有受到明显的抑制，表明过表达NtNAC4基因提高了植株的抗旱能力烟草（Nicotiana tabacum L.）为茄科（Solanaceae）烟草属（Nicotiana）特种经济作物，在我国的大部分地区都有种植高温、干旱、冷害、高盐等极端环境严重影响了烟草的生长发育，进而对其品质造成损害本研究运用RT-PCR的方法对NtNAC055基因进行分离克隆，对其表达模式、亚细胞定位以及转录激活活性进行分析，旨在探讨烟草抗逆性的调控机制和内在机理，为后期培育抗逆新品种提供理论依据1材料与方法1.1试验材料种植材料为普通烟草K326DH5α大肠杆菌感受态细胞和亚克隆载体购自北京全式金公司，GV3101農杆菌感受态细胞和AH109酵母感受态细胞购自博迈德生物公司GFP标签载体pYG56-GFP和pBridge载体由本实验室保存同源重组酶（Infusion）、PrimeSTAR Max DNA Polymerase购自宝生物工程（大连）有限公司，限制性内切酶购自NEB公司。

植物总RNA提取试剂Trizol购自康为世纪生物科技有限公司，反转录试剂盒PrimeScript? RT reagent Kit、qRT-PCR试剂、酵母培养基购自宝生物工程（大连）有限公司，DNA胶回收和质粒提取试剂盒购自天根公司1.2试验方法1.2.1烟草材料种植和处理供试普通烟草品种K326于2020年5月种植在中国农业科学院烟草研究所气候室对K326种子进行消毒，首先用75%酒精浸泡20 s，无菌水洗2次，再用15%的H2O2浸泡8～12 min，最后再用无菌水洗4～5次将消毒过的烟草种子均匀地铺在MS固体培养基上，待长至4片真叶期，将长势一致的烟苗分别转移到含有100 mmol/L NaCl、10 μmol/L ABA、PEG-6000（5%）的相应培养基上，在4 ℃和37 ℃光照培养箱中模拟低温胁迫和热胁迫在处理时间为0、1、3和6 h时对处理的烟苗进行整株采样，每个处理每次采集3株，每株作为一个生物学重复，液氮速冻后转移至–80 ℃冰箱中保存、备用将MS固体培养基上长势一致的4片真叶期烟苗移栽至装有营养土的花盆里，置于气候室正常培养在烟株盛花期，采集正常生长植株的根、茎、幼叶、成熟叶、衰老叶、花及腋芽。

根部组织取样时，将烟草根系部位营养土用水轻轻冲洗干净，剪取侧根采集样品时，先将样品放入液氮中，然后转移至–80 ℃冰箱中保存备用1.2.2总RNA的提取、反转录将采集的不同组织样品以及胁迫处理的样品在液氮中研磨至粉末，使用Trizol试剂提取各样品的总RNA，并利用反转录试剂盒PrimeScript? RT reagent Kit对提取的总RNA进行cDNA第一链的合成，将反转后的cDNA置于–20 ℃保存，备用1.2.3NtNAC055基因的克隆以拟南芥ANAC055蛋白序列为query序列，在茄科基因组数据库（http：// P比对，获得候选基因（Nitab4.5_0001204g0100.1），根据基因的编码区设计PCR扩增引物（NtNAC055-F：5-ATGGGTGTTCAGGAAATGGACC-3;NtNAC05 5-R 5-TTACCGACTGAAACCCATATTCACT-3），以普通烟草K326根部cDNA为模板，使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行基因扩增PCR反应体系为：PrimeSTARMax Premix 25 μL，引物F 1.5 μL，引物R 1.5 μL，cDNA 1.5 μL，用ddH2O补充至50 μL。

PCR反应程序：98 ℃变性10 s，55 ℃ 退火10 s，72 ℃延伸20 s;32个循环PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将1000 bp左右的目的条带切下经凝胶回收纯化试剂盒回收纯化，回收的目的片段与亚克隆载体连接，取5 μL连接产物转化至DH5α细胞中，在LB固体培养基上（Kan 100 μg/ml）37 ℃培养，进行筛选，挑取经PCR鉴定为阳性的单克隆送至上海生工生物工程有限公司测序1.2.4NtNAC055基因生物信息学分析使用ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）工具，分析NtNAC055蛋白的分子量、理论等电点在拟南芥基因组数据库TAIR（www.arabidopsis.org）下载拟南芥ATAF1、ATAF2、AtNAP、RD26、ANAC055、ANAC019、AtNAC2和AtNAC3等胁迫相关的NAC转录因子蛋白序列在茄科基因组数据库（http：// index.html）中下载。