总结总、直接胆红素的检测方法.doc

血清总胆红素和直接（结合）胆红素测定目前测定血清胆红素的方法主要有重氮试剂法（包括改良 J-G 法、二甲亚砜法、二氯苯重 氮盐法和 2，5 二氯苯重氮四氟硼酸盐法等） 、胆红素氧化酶法、钒酸盐氧化法、高效液相 色谱法、导数分光光度法、经皮胆红素测定法以及直接分光光度法等 改良咖啡因（改良咖啡因（J-G）法：）法： 一、实验原理血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成紫色的偶氮胆红素；在同样条件下， 未结合胆红素须有加速剂破坏胆红素氢键后才能与重氮试剂反应咖啡因、苯甲酸钠作为 加速剂，醋酸钠缓冲液可维持反应的 PH 值同时兼有加速作用叠氮钠破坏剩余重氮试剂， 终止结合胆红素测定管的偶氮反应最后加入碱性酒石酸钠，在碱性条件下，紫色偶氮胆 红素转变为蓝色偶氮胆红素，使最大吸光度由 530nm 转移到 598nm，此时，非胆红素的黄 色色素及其它红色与棕色色素产生的吸光度可忽略不计，使测定的灵敏度和特异性增加 最后形成的绿色是由蓝色的碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素 混合而成 二、实验方法 （一）器材 试管，刻度吸管，分光光度计，37℃水浴箱 （二）试剂 1．咖啡因-苯甲酸钠试剂 无水醋酸钠 41g，苯甲酸钠 37.5g，EDTANa2 0.5g，溶于约 500mL 的蒸馏水中，再加入咖啡因 25g，搅拌至完全溶解(不可加热)，然后加蒸馏水稀释 至 1000mL，混匀，过滤后放置棕色试剂瓶中，室温保存可稳定 6 个月。

2. 5g/L 亚硝酸钠溶液：亚硝酸钠 5.0g，加蒸馏水溶解并稀释至 100mL，若发现溶液呈淡 黄色时，应丢弃重配 3. 5g/L 对氨基苯磺酸溶液：对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H20）5.0g，加于约 800mL 蒸馏水中，加浓盐酸 15mL，待完全溶解后，加蒸馏水至 1000mL 4. 重氮试剂 临用前，取 5g/L 亚硝酸钠溶液（试剂 2）0.5mL 与 5g/L 对氨基苯磺酸溶液 （试剂 3）20mL 混合 5. 5g/L 叠氮钠溶液：叠氮钠 0.5g，用蒸馏水溶解并稀释至 100mL 6. 碱性酒石酸钠溶液：氢氧化钠 75g，酒石酸钠(Na2C4H4O6·2H2O)263g，加蒸馏水溶解 并稀释至 1000mL，混匀，置塑料瓶中，室温保存可稳定 6 个月 7.胆红素标准液 可购买，也可按以下方法配制： （1）稀释血清：收集不溶血、无黄疽、清晰的血清过滤作为混合血清稀释剂取过滤血清 1.0ml，加生理盐水 24ml，混匀在分光光度计中，以比色杯光径 1cm，波长 414nm，用 生理盐水调零，读取的吸光度应小于 0.100，波长 460nm 处读取的吸光度应小于 0.040。

（2）171umol/L 胆红素标准液：称取符合标准的胆红素（MW:584.68）10mg，加入二甲基 亚砜 1ml，玻棒搅匀，加入 0.05mol/LNa2CO3 溶液 2ml，使胆红素完全溶解移入 100ml 容量瓶，用稀释血清洗涤数次并移入容量瓶中，缓慢加入 0.1mol/LHCl 溶液 2ml（边加边 缓慢摇动，切勿产生气泡） ，最后用稀释血清稀释至 100ml避光，4℃保存，三天内有效， 最好当天绘制标准曲线 （三）步骤 1. 取试管 3 支，标明总胆红素管、结合胆红素管和空白管，然后按下表操作： 试剂(ml) 总胆红素管 结合胆红素管 空白管血清 0.2 0.2 0.2 咖啡因-苯甲酸钠试剂 1.6 - 1.6氨基苯磺酸溶液 - - 0.4 重氮试剂 0.4 0.4 -混匀，总胆红素管置室温 10min，结合胆红素管置结合胆红素管置 37℃37℃水浴准确放置水浴准确放置 1min1min，，按下表继续操 作：叠氮钠溶液 - 0.05 - 咖啡因-苯甲酸钠试剂 - 1.55 - 碱性酒石酸钠溶液 1.2 1.2 1.2 充分混匀后，用空白管调零，于波长 600nm，读取总胆红素管和结合胆红素管吸光度，在 标准曲线上查出相应的胆红素浓度。

胆红素氧化酶法胆红素氧化酶法 一、实验原理胆红素呈黄色，在 450nm 附近有最大吸收峰胆红素氧化酶(BOD)催化胆红素氧化， 随着胆红素被氧化，A450nm 下降，下降程度与胆红素被氧化的量相关在 pH8.0 条件下， 未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，因而检测 450nm 吸光度的下降值可反映总胆红素含 量；加入 SDS 及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进其氧化 在 pH3.7～4.5 缓冲液中，BOD 催化单葡萄糖醛酸胆红素(mBc)、双葡萄糖醛酸胆红素 (dBc)及大部分 δ 胆红素氧化，非结合胆红素(Bu)在此 pH 条件下不被氧化用配制于人血 清中的二牛磺酸胆红素(ditaurobilirubin，DTB)作标准品，检测此条件下 450nm 吸光度的下 降值可反映结合胆红素的含量 二、实验方法 1．0.1mol/LTris-HCl 缓冲液(pH8.2) 称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.211g，胆酸钠 172.3mg, 十二烷基硫酸钠(SDS)432.6mg，溶于去离子水 90ml 中，在室温(25～30℃)用 1mol/L 盐酸 调节 pH 至 8.2(约用 6ml)，再加蒸馏水至 100ml，置冰箱保存，此液含 4mmol/L 胆酸钠、 15mmol/L SDS。

2．0.2mol/L 磷酸盐缓冲液(pH4.5) 3．BOD 溶液 如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜过长(约可保存 1 周)，如系液体(可能含有甘油)，置 4℃冰箱可保存较长时间，BOD 贮存溶液的酶活性一般 在数千至 1 万～2 万 U/L，BOD 工作液酶活性可按反应液中 BOD 终浓度达 0.3～1.0U/ml 计算 4．总胆红素标准液(342μmol/L) 按胆红素测定 J-G 法中方法配制，或市售合乎要求的标 准液 5．结合胆红素标准液 将 DTB 配于胆红素浓度可忽略不计的人血清中，或用冻干品按说 明书要求重建配制后分装于聚丙烯管内，－70℃保存，可稳定 6 个月冻干品未重建前 置低温中，至少稳定 1 年加入 BOD 工作液后立即混匀，置置 37C 水浴水浴 5min，，用分光光度计，在 450nm 波长，去离子 水调零，读取各管吸光度(A)用于对照管的比色杯与非对照管的比色杯不得混用 钒酸盐氧化法钒酸盐氧化法(试剂盒试剂盒) 一、原理 在 PH=3 左右，有表面活性剂和间接反应胆红素抑制剂的条件下，样品中的直接胆红 素被氧化剂钒酸钠氧化为胆绿素胆红素的黄色特异性吸光度下降，通过测定钒酸盐氧化 前后吸光度的变化，计算样品中直接胆红素的含量。

二、实验方法 试剂：柠檬酸缓冲液 100mM表面活性剂 2mmol/L磷酸缓冲液 10mM偏钒酸钠 4mmol/L 适用于半半/全自动生化分析仪全自动生化分析仪，两周内用完样本/标准/水sample volumeμ114试剂 1（R1）Reagent 1μl280样本+R1 在 37℃保温 60 秒，记录吸光度值 A1试剂 2（R2）Reagent 2μl70在加入 R2 保温 300 秒后，记录吸光度值 A2主波长main wavelengthnm450副波长sub wavelengthnm546反应类型reaction type 两点终点法反应方向reaction direction 降反应(-)。