第二章--目的基因连接及导入ppt课件.ppt

*1第五节 目的基因与载体连接基因工程之“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”二、 目的基因与载体的连接（接）质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA 连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程上是不同来源的基因重组的过程雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程” （主要有以下4种连接方式） 1) 粘性末端连接 2） 平头末端连接 3） 人工接头法 4） 同源多聚尾连接法工具酶：基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类几种重要的工具酶 活性 限制性核酸内切酶 识别特异碱基序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA5-磷酸与3-羟基 形成磷酸二酯键 DNA聚合酶 以DNA为模板合成DNA 逆转录酶 以RNA为模板合成cDNA 碱性磷酸酶 切除5末端磷酸T4多聚核苷酸激酶 催化核酸5-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶 催化3-端合成同聚尾“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。

DNA连接酶 E. coli DNA 连接酶只能催化互补粘性末端之间的连接DNA 连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3-OH 末端与5-P末端之间形成磷酸二酯键，使末端连接 T4 DNA 连接酶催化互补粘性末端和平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低 雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程” 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子 用同一种或两种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点 （一） 粘性末端连接有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来 质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒核酸酶S1本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！（二）平头末端连接“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。

三） 人工接头法 合成连接子与DNA平头末端连接限制酶切割,产生粘性末端连接，构建重组DNA雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”用接头连接 用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因+DNA连接酶接头(linker)本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”四）同源多聚尾连接法“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”尾接法 DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶+dGTP末端转移酶+dCTP本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。

基因与载体的平末端连接方法有哪些？(1)T4DNA连接酶法 连接平末端DNA分子的方法有2种，一种是直接用T4DNA连接酶连接，另一种是先用末端核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接T4DNA连接酶同一般的大肠杆菌DNA连接酶不同T4DNA连接酶除了能够封闭具有3-OH和5-P末端的双链DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高浓度酶的条件下,它还能够连接具有完全配对碱基的平末端DNA分子,但其连接效率比粘性端要低的多雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”2） 同聚物加尾法 5特意的核酸外切酶处理目的基因及质粒的平末端，移去几个末端核苷酸运用末端核苷酰转移酶，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3-OH基因上,它并不需要模板链的存在,它一个一个加上核苷酸,构成由核苷酸组成的尾巴,长度可达100个核苷酸在载体中加入dTTP和末端核苷酸转移酶，在载体3OH末端延伸形成单链PolyT尾巴将两者混合发生互补连接，缺口用DNA连接酶封闭。

雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”3）用化学合成的衔接物连接 DNA分子用化学合成法合成一段1012个核苷酸，具有限制酶识别位点的寡核苷酸片段，磷酸化后，通过T4DNA连接酶，将片段分别于载体5端和目的基因片段5连接起来用相应的限制性内切酶处理，产生互补的粘性末端 4）T-A克隆法： TagDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时，还能不依赖模版在产物3末端加上两个游离的A只要载体切口除人工加上的游离T，PCR产物即可于载体连接雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”T-A克隆T-vector两条链的5端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3端多加一个A“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。

2.用_切断目 的基因，使其产生_ _3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶（如EcoRI）消化酶切后, 两者的两端均具有相同的粘性末端, 称为单酶切点的粘性末端, 又称全同源性粘性末端 高背景 载体经单一限制性核酸内切酶切割后, 载体分子易于自我环化, 既不利于目的基因的重组连接, 大大降低阳性克隆效率, 又可使非重组性载体造成高背景为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的 5-P以抑制DNA的自我环化在连接反应中, 具有5-P的目的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性末端发生互补连接, 尽管产生的重组DNA分子于连接点含有两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环, 但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。

双向插入 经单一限制核酸内切酶（如EcoRI）切割的目的基因和载体, 因二者的粘性末端是相同的, 因此在连接反应中, 目的基因可发生双向插入, 载体对目的基因表达是有方向的, 而目的基因可双向与之相连, 这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响, 若以表达为目的, 我们就要对插入的片段进行方向鉴定, 因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的, 一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的mRNA若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组, 以便定向克隆YL) *19第六节 重组DNA导入受体细胞基因工程之“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning) 由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞不同，将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不相同。

转重组DNA导入宿主细胞“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程” 受体细胞：也叫宿主细胞，是指在转化、转导、杂交中接受外源基因的细胞分为原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真核受体细胞 (最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞(其实也是真核受体细胞)具有接受外源DNA的能力；为限制性内切酶缺陷型菌珠或为DNA重组型菌珠 ；在标记上和载体对应；有利于表达；不适宜在人体或非培养条件下生存，有利于安全受体细胞条件“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”原核生物细胞是较为理想的受体细胞：没有细胞壁，便于外源DNA 的进入；没有核膜，染色体DNA 没有固定结合的蛋白质，便于外源DNA与染色体DNA 重组；基因组小，遗传背景简单，便于外源基因的遗传分析；容易获得一致性的实验材料，培养简单，繁殖迅速，易重复雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。

表达真核生物基因存在一定的缺陷，很多真核生物基因往往不能在原核生物细胞内表达出具有生物活性的功能蛋白需要进行适当的修饰“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”酵母作为受体细胞，除了真核生物细胞共有的特性外，还具有以下优点：基因结构相对简单，其基因表达调控机制研究比较清楚，便于基因工程操作；培养简单，适于大规模生产，成本低廉；可以分泌表达，便于产物的提取和加工；不产生毒素，是安全的受体细胞真核生物细胞-酵母受体细胞“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”植物细胞作为受体细胞，除了真核细胞共有的特性外，最突出的优点就是其体细胞的全能性，一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系不足之处是植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA 分子雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。

动物细胞同样可以作为受体细胞。