用尼氏染色法观察小鼠海马及皮层中神经元的分布情况.doc

用尼氏染色法观察小鼠海马及皮层中神经元的分布情况用尼氏染色法观察小鼠海马及皮层中神经元的分布情况一、一、 【【实验目的实验目的】】：： 通过本实验学习如何用尼氏染色法来观察小鼠脑组织中神经元的分布情况 二、二、 【【实验原理实验原理】】：： 尼氏染色法（Nissl staining）是德国病理学家 F.Nissl（1860-1919）于 1892 年创立的，碱性染料染色后发现了神经元胞体中的尼氏体尼氏体 （Nissl body）是胞质内的一种嗜碱性物质，广泛见于各种神经元，但其形状 大小和数量则各有差异 神经元是神经系统的结构和功能单位,尼氏体是神经元的特征性结构之一, 尼氏体又称虎斑,存在于神经元胞体和树突内,具有嗜碱性的特点以往显示神 经元中尼氏体多采用苏木精-伊红染色方法,此法虽然也能观察到胞质中嗜碱性 颗粒,但结构不甚清晰,胞核、核仁、尼氏体颗粒模糊,分界不清,轴突、树突难 以辨认在尼氏染色中尼氏体清晰可辨,核、核仁也非常清晰,而且很容易区分 轴突和树突,收到了既可辨认器官又可同时观察细胞质特殊结构的效果在电镜下观察，尼氏体主要由平行排列的粗面内质网和核糖体组成尼氏 体的主要功能是合成蛋白质，作为神经活动时所需，如细胞中的某些成分的更 新以及产生神经递质有关的蛋白质和酶类。

轴突端的蛋白质大都来自胞体的尼 氏体神经元在兴奋传导过程中，不断消耗某些蛋白质物质，尼氏体可合成新 的蛋白质以补充这种消耗 用于尼氏染色的常用染料有：焦油紫（cresyl violet） 、硫堇 （thionine）和甲苯胺蓝 (toluidine blue)Nissl 染色液染色后呈蓝紫色， 常用于显示脑或脊髓的基本神经结构Nissl 小体大而数量多，说明神经细胞 合成蛋白质的功能较强；相反在神经细胞受到损伤时，Nissl 小体的数量会减 少甚至消失 三、三、 【【实验材料实验材料】】：：实验动物：昆明小鼠 实验试剂：0.48%的戊巴比妥钠、4%多聚甲醛；生理盐水、1×PBS；双蒸水、 甲苯胺蓝、0.5%明胶酒精（75%、95%、100%） 、二甲苯、中性树脂 实验器材：载玻片、盖玻片、振荡切片机、24 孔板、小笔刷、染缸、注射 器、手术器械（手术剪刀、镊子） 、输液管、光学显微镜 四、四、 【【方法与步骤方法与步骤】】：： 1、昆明小鼠以 0.48%的戊巴比妥钠 0.02ml/g 腹腔注射麻醉，待其麻醉后， 迅速用手术剪刀及镊子剪开肚皮使其心脏暴露，将针头从右心房插入，并用动 脉夹夹住，剪破静脉窦。

2、灌流和固定：先用生理盐水灌注（约 30min） ，待小鼠肝脏变白后，再 换成 4%多聚甲醛灌流，直到小鼠肝脏变硬，尾巴僵硬为止（约 2h） 3、待充分固定后，剪下小鼠头部并开颅取脑，再浸入 4%多聚甲醛 1d 4、将脑组织用 502 胶水固定，在振荡切片机上切片，厚度为 25μm 5、将切好的脑片浸于 0.5%的明胶中，用毛刷将脑片贴到预先用明胶处理 的载玻片上，然后自然风干 6、将脑片置于 0.5%甲苯胺蓝（母液：甲苯胺蓝 1g，无水乙醇 100ml使 用时按 1:1 比例与新鲜的 0.1%NaCl 溶液混合成工作液）或焦油紫（焦油紫0.1g；蒸馏水 99ml；1%冰醋酸 1ml）中室温下染色 30min 7、75%、95%、100%酒精中各脱色 1min，二甲苯透明 10min，中性树胶封片8、显微镜下观察照相并对尼氏染色阳性神经元进行计数 五、五、 【【注意事项注意事项】】：： Nissl 染色液的染色能力很强，并且染色后很难去除，请注意勿使染色液沾 染皮肤和衣物等二甲苯具有中等毒性，对眼及上呼吸道有刺激作用，高浓度 时，对中枢系统有麻醉作用，故切片用二甲苯透明时勿必在通风橱中进行。

六、六、 【【思考题思考题】】：： 1、除了尼氏染色法以外，你知道还有哪些方法可以对神经元进行特殊的染色， 并详述其原理和步骤 2、。