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植物细胞器的分离3讲解.pdf

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    • 2 植物细胞器的分离 一、叶绿体的分离: 1.实验原理: 采用差速离心法,利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同,把叶绿体的颗粒沉降出来 2.实验材料及试剂: 成熟的猪笼草 、山梨醇、Tris、EDTA 与 β-巯基乙醇均为 Amresco 产品、 细胞器分离缓冲液:300 mmol/L 山梨醇, 50mmol/L Tris-HCl(pH 为 8.0), 5 mmol/L EDTA(pH 8.0), 0.1%β-巯基乙醇(临用前加入) 3.实验器材: SG350C 多功能食品料理机(上海天航电器有限公司) , GL21M 高速冷冻离心机及配套的 2 号角转头(湘仪集团) 表 1 叶绿体分离试剂配置 名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实际 g 母液体积 备注 山梨醇 0.3 mol/L 100ml 10ml 3mol/L 54.651 100mL Tris-HCl 0.05mol/L 0.05mol/L 100ml pH 8.0 EDTA 0.005 mol/L 100ml 1ml 0.5mol/L 14.6124 100mL pH 8.0 β-巯基乙醇 0.1% 100ml 100ml 0.1% 0.1 100ml 蔗糖 52% 100ml 100ml 52% 52 100ml 蔗糖 30% 100ml 100ml 30% 30 100ml EDTA 0.025 mol/L 100ml 100ml 2.5mol/L 73.062 100mL pH 8.8 EDTA 0.025 mol/L 100ml 100ml 2.5mol/L 73.062 100mL pH 8.0 计算过程: 山梨醇:配制体积:100 mL,浓度:3 mol/L;分子量:182.17g/mol 需要称取质量 g:=100 mL*3 mol/L*182.17g/mol=0.1L*3 mol/L*182.17g/mol=54.651g EDTA: 配置体积:100ml , 浓度:0.5mol/lL ,分子量:292.248g/mol m= 0.5mol/L *100mL *292.248g/mol =14.6124 g LEDTA : 配置体积:100ml 浓度:25mol/L ,分子量:292.248g/mol m=2.5mol/L*100mL * 292.248g/mol=73.062g 4.制备方法 4.1 叶绿体粗提物的制备 (1). 取 25 g 叶片置于 100 mL 充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆 2 min(5000r/min), (2). 然后将匀浆液用 4 层纱布过滤于 500ml 烧杯, (3). 滤液于 4℃、700g 在 1000r/min 离心 10 min, (4).弃去细胞核沉淀上清液再于 4℃、2 000 g 在 3000r/min 离心 10min,所得沉 2 淀即为叶绿体粗提物, (5).将此粗提物悬浮于 7.5 mL 细胞器分离缓冲液中备用。

      4.2 密度梯度离心制备完整叶绿体 (1).用 50 mL 离心管制备蔗糖梯度,底部为 18 mL 含 52%(质量分数)的蔗糖,50 mmol/L Tris-HCl(pH 为 8.8),25 mmol/L EDTA(pH 为 8.8)的混合液, 上面用 7 mL 含 30%蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl(pH 为 8.0)、25 mmol/L EDTA(pH为 8.0)的混合液覆盖 (2). 将上述所得叶绿体粗提取物小心覆盖于 30%的蔗糖上面,平衡后在 4℃、20 kr/min 离心 30 min (3).处于 52%蔗糖与 30%蔗糖界面上的绿色条带即为完整叶绿体 (4).用加样枪小心吸出绿色的条带 5.叶绿体的显微鉴别: 叶肉细胞中的叶绿体,散布于细胞质基质中,呈绿色,扁平的椭球形或球形可以在高倍显微镜(400~600)下观察到它的形态和分布 二、线粒体的分离 1.实验原理: 利用沉降系数不同的颗粒,在一定介质中沉降速度的差异,采取分级差速离心的方法,将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来 2.实验材料及试剂: 实验材料成熟的拟南芥,琼脂糖为杭州微生物试剂厂产品;牛血清蛋白(BSA)为上海试剂厂产品;DNase 和 RNase 为上海生物工程技术服务有限公司产品; 溴化乙锭为 SerVa 公司产品;其余试剂均为国产分析纯.1×TAE 电泳缓冲液(称取242 g Tris 溶于适量蒸馏水中,加入 57. 1 mL 冰乙酸, 100 mL 0.5mol·L1EDTA,pH= 8. 0,用蒸馏水定容至 1 L 即为 50×TAE 转换为 1 ×TAE 稀 50 倍)缓冲液 A:蔗糖 0. 5 mol·L-1, Tris-Cl 50mmol·1,EDTA5mmol·L-1,BSA 0. 1%,PVP0. 5%, 0. 1%β-巯基乙醇,pH= 7. 5.缓冲液 B:蔗糖 0. 5 mol·L-1, Tris-Cl 50mmol·L-1, pH= 7. 5.缓冲液 C:蔗糖 0. 6 mol·L-1, Tris-Cl 10mmol·L-1,EDTA 20mmol·L-1, pH= 7. 2.缓冲液 D: 0. 1 mol·L-1Tri-HCl(pH= 8. 0),0. 05 mol·L-1EDTA (pH= 8. 0), 0. 1mol·L1NaCl,10%SDS, 0. 01mol·L-1β-巯基乙醇. 表 2 线粒体分离试剂配置 名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实际g 母液体积 备注 EDTA 0.5mol/L 100ml 100ml 0.5mol/L 14.6124 100mL Ph=8 缓冲液A 蔗糖 0. 5 mol·L-1 100ml 100ml 0.5mol/L 17.115 100mL Tris-Cl 0.05mol·1 100ml 10ml 0.5mol/L 6.057 100mL EDTA 0.005mol·11L-1 100ml 1ml 0.5mol/L 14.6124 100mL BSA 0. 1% 100ml 100ml 0.1% 0.1 100ml PVP 0. 5% 100ml 100ml 0.5% 0.5 100ml β-巯基乙醇 0. 1% 100ml 100ml 0.1% 0.1 100ml pH=7.5 2 缓冲液B 蔗糖 0. 5 mol·L-1 100ml 100ml 0.5mol/L 17.115 100ml Tris-Cl 0.05mol·L-1 100ml 10ml 0.5mol/L 6.057 100mL pH=7.5 缓冲液C 蔗糖 0. 6 mol·L-1 100ml 100ml 0.6mol/L 20.538 100mL Tris-Cl 0.01mol·L-1 100ml 10ml 0.1mol/L 1.2114 100mL EDTA 0.02mol·L-1 100ml 10ml 0.2mol/L 5.845 100mL pH=7.2 缓冲液D Tri-HCl 0. 1 mol·L-1 100ml 100ml 0.1mol/L 1.2114 100mL pH=8.0 EDTA 0.05mol·L-1 100ml 10ml 0.5mol/L 14.6124 100mL pH=8.0 NaCl 0. 1 mol·L-1 100ml 100ml 0.1mol/L 0.5844 100mL SDS 10% 100ml 100ml 10% 10 100ml β-巯基乙醇 0.01mol·L-1 100ml 10ml 0.1mol/L 0.7813 100mL 计算过程: EDTA:配置体积:100ml , 浓度: 0.5mol/L, 分子量:292.248g/mol m= 0.5mol/L*100mL /*292.248g/mol =14.6124g. 蔗糖:配置体积:100ml , 浓度:0.5mol/L ,分子量:342.3g/mol m= 0.5mol/L *100mL*342.3g/mol=17.115g. LTris-Cl:配置体积:100ml , 浓度:0.5mol/L ,分子量:121.14g/mol m= 0.5mol/L*100ml*121.14g/mol=6.057g. 蔗糖:配置体积:100ml ,浓度:0.5mol/l , 分子量:342.3g/mol m=0.5mol/L*100mL*342.3g/mol=17.115g. 蔗糖: 配置体积:100ml , 浓度:0.6mol/L ,分子量:342.3g/mol m= 0.6mol/L*100mL*342.3g/mol=20.538g. Tris-Cl:配置体积:100ml, 浓度:0.1mol/L , 分子量:121.14g/mol m= 0.1mol/L*100mL*121.14g/mol=1.2114g. EDTA:配置体积:100ml ,浓度:0.2mol/l , 分子量:292.248g/mol m= 0.2mol/L*100mL*292.248g/mol=5.845g. NaCl : 配置体积:100ml ,浓度: 0.1mol/L , 分子量:58.44g/mol m= 0.1mol/L*100mL*58.44g/mol=0.5844g. β-巯基乙醇: 配置体积:100ml ,浓度:0.1mol/L , 分子量:78.13g/mol m= 0.1mol/L*100ml*78.13g/mol=0.7813g. 3.实验仪器: 超速冷冻离心机、制冰机、研钵(Υ= 15 cm)、无菌纱布、大离心管(50mL)、水浴锅、微量离心管(1. 5 mL)、微量离心机(1. 5mL 管)、-20℃冰箱、自动扩增仪、凝胶成像系统、紫外灯. 4.实验方法: (1).采集叶片 30 g 左右(采集前需暗培养24~28 h,以减少叶片组织所含糖类的污染); (2).用蒸馏水洗涤 2~3 次,置研钵中(研钵提前预冷),加适量预冷缓冲液 A 和少量的石英砂在冰上研磨,直至缓冲液为深绿色; (3).用 6 层无菌纱布过滤匀浆组织(并用缓冲液 A 漂洗纱布),然后将磨碎组织放回研钵中重新研磨并过滤, 2 次滤液合并,补加缓冲液 A 至 3~5mL·g-1 试材,并将滤液分装于 4 个 50mL 无菌离心管中, 1 000 g 离心 10m in,收集上清液; (4).将上清液 2 000 g 离心 10m in,再收集上清液于20 000 g离心 10m in 得到粗线 2 粒体沉淀,在粗线粒体沉淀中加入每管10mL 预冷的缓冲液 B 用软笔轻轻悬浮沉淀,注意应悬浮均匀后,将粗线粒体悬液 1 000 g 离心 10min; (5).收集上清液于同一 50mL 无菌离心管,加入 300μL 1mol·L-1 的 MgCl2 至终浓度 0. 01mo·L-1,和 5mg·mL-1 的 DNaseⅠ至终浓度 20μg·mL-1,冰浴放置 1. 5~2 h,在冰浴液中加入1. 5mL 0.5mol·L1 的 EDTA(pH=8.0)至终浓度 20mmol·L-1; (6).将上述溶液小心铺于缓冲液 C 上(每管 25mL C 缓冲液), 18 000 g 离心 20 m in;收集沉淀重新悬浮于装 20 mL 预冷缓冲液 C 的离心管中,18 000 g 离心 10m in,得到较纯的线粒体沉淀.以上操作均在 0~4℃条件下进行. 5.显微鉴别: 线粒体在光学显微镜一般呈短棒状或圆球状,但必须借助健那绿 (Janus green B)染液,使得线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态. 因此可以使活细胞中的线粒体呈现蓝绿色,而细胞质接近无色.线粒体能在健那绿染液中维持活性数小时,通过染色,可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布.配制质量分数为 1%健那绿染液(将 0.5g 健那绿溶解于 50mL 生理盐水中,加温到 30-40摄氏度,使其充分溶解). 三、细胞核的分离: 1.原生质体制备: (1).取生长 3~4 d 的拟南芥悬浮系细胞 1 700 rpm 离心 3min.静置沉淀, (2).用 0.4 mol L 甘露醇短暂洗涤后置于 20mL 酶解缓冲液(5mmol/LMES,6.8 mmol/LCaCl2, 11 mmol/LKH2PO4, 0.3mol/LMannitol, 0.3mol/Lsorbitol, 0.4%PVP-K30, 2%cellulast, 0.5%Macerozyme,pH5.7)酶解 4.5 h. 名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实 际g 母液体积 备注 甘露醇 0.4mol/L 20ml 20ml 0.4mol/L 7.2868 100mL MES 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 0.005 mol/L 20ml 0.2ml 0.5mol/L 10.6625 100mL CaCl2 0.0068 mol/L 20ml 0.2ml 0.68mol/L 7.54664 100mL KH2PO4 0.011 mol/L 20ml 2ml 0.11mol/L 1.497 100mL Mannitol 甘露醇 0.3mol/L 20ml 20ml 0.3mol/L 5.4651 100mL Sorbitol 山梨糖醇 0.3mol/L 20ml 20ml 0.3mol/L 5.4651 100mL PVP-K30 0.4% 0.4% 0.4 100ml Cellulast 纤维素酶 2% 2% 2 100ml Macerozyme 浸解酶 0.5% 0.5% 0.5 100ml Ph=5.7 计算过程: 2 甘露醇:配制体积:100ml , 浓度:0.4mol/l , 分子量:182.17g/mol m= 0.4mol/L*100ml*182.17g/mol=7.2868g. MES :配置体积:100ml , 浓度:0.5mol/L ,分子量:213.25g/mol m= 0.5mol/L*100ml*213.25g/mol=10.6625g. CaCl2 :配置体积:100ml ,浓度:0.68mol/L ,分子量:110.98g/mol m= 0.68mol/L*100mL*110.98g/mol=7.54664g. KH2PO4 :配置体积:100ml ,浓度:0.11mol/L ,分子量:136.09g/mol m= 0.11mol/L*100mL*136.09g/mol=1.497g. Mannitol 甘露醇:配置体积:100ml , 浓度:0.3mol/L , 分子量:182.17g/mol m= 0.3mol/L*100mL*182.17g/mol=5.4651g. Sorbitol 山梨糖醇:配制体积:100ml , 浓度:0.3mol/L ,分子量:182.17g/mol m= 0.3mol/L*100ml*182.17g/mol=5.4651g. PVP-K30 : m=(50g*0.4%)/(1-0.4%)=0.2008g. (3).摇床设定 70 rpm,28℃ .三层纱布过滤一次, (4).滤液经 1 700 rpm 离心 3min,去上清, (5).用洗涤缓冲液(5 mmol/LMES,0.2mol/Lsorbitol,0.2mol/LManmitol(pH5.7))洗涤2 次即可得到分散均匀的原生质体. 名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实际g 母液体积 备注 MES 0.005 mol/L 100ml 1ml 0.5mol/L 10.6625 100mL sorbitol 0.2mol/L 100ml 100ml 0.2mol/L 3.6434 100mL Manmitol 0.2mol/L 100ml 100ml 0.2mol/L 3.6434 100mL pH=5.7 计算过程: MES :配置体积:100ml ,浓度:0.5mol/L, 分子量:213.25 m= 0.5mol/L*100mL*213.25g/mol=10.6625g. sorbitol :配制体积:100ml ,浓度:0.2mol/L , 分子量:182.17g/mol m= 0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g. Manmitol:配置体积:100ml ,浓度:0.2mol/L ,分子量:182.17g/mol m= 0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g. 2.细胞核与叶绿体的分离提纯 为保证提纯的细胞器中组分免受破坏,以下步骤均要在 0~4℃下进行. 2.1 细胞核与叶绿体的粗提 (1). 向原生质体中加入含有 0.5%Triton X-100 的 CSK 缓冲液(100 mmol/L KCl,3 mmol/LMgCl2,1mmol/LEGTA(pH8.0),10mmol/LPIPES(pH6.8),300mmol/Lsucrose,1.2 mmol/L PMSF,20 mmol L DTT),振荡混匀后,静置 7 min.溶去原生质体膜但保证细胞核和叶绿体的膜系统不被破坏. (2).取 120g 离心 10min,弃上清液. (3).用 CSK 缓冲液重悬沉淀, (4). 20μm 孔径的滤膜过滤, (5).取 120g 离心 10 min,得到的沉淀为粗提的细胞核与叶绿体的混合物, (6).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核与叶绿体的初步分离情况. 2 2.2 细胞核与叶绿体的纯化 (1). 把含有 2.3mol L 蔗糖的 CSK 缓冲液(100mmol LKCl, 3 mmol L MgCl2 ,1 mmol L EGTA(pH8.0), 10mmol LPIPES(pH6.8), 2.3 mol L sucrose, 1.2 mmol LPMSF, 20mmol LDTT)加至于离心管底部, 名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实际g 母液体积 备注 KCl 0.1molL 100ml 100ml 0.1mol/L 0.746 100mL MgCl2 0.003 mol L 100ml 1ml 0.3mol/L 2.8563 100mL EGTA 0.001 mol L 100ml 1ml 0.1mol/L 3.8035 100mL pH=8.0 PIPES 0.01molL 100ml 10ml 0.1mol/L 3.024 100mL pH=6.8 sucrose蔗糖 2.3 mol L 100ml 100ml 2.3mol/L 78.729 100mL 苯甲基磺酰氟 (剧毒)PMSF 0.0012 molL 100ml 1ml 0.12mol/L 2.09028 100mL DTT 二硫苏糖醇 0.02mol L 100ml 10ml 0.2mol/L 3.085 100mL 计算过程: KCl :配制体积:100ml ,浓度:0.1mol/L ,分子量:74.6g/mol m= 0.1mol/L*100mL*74.6g/mol=0.746g. MgCl2:配置体积:100ml ,浓度:0.3mol/L , 分子量:95.21g/mol m= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g. EGTA :配置体积:100ml ,浓度:0.1mol/L , 分子量:380.35g/mol m= 0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g PIPES:配置体积:100ml ,浓度:0.1mol/L ,分子量:302.40g/mol m= 0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024g. sucrose:配置体积:100ml ,浓度: 2.3mol/L ,分子量:342.3g/mol m= 2.3mol/L*100mL*342.3g/mol=78.729g. PMSF:配置体积:100ml ,浓度:0.12mol/L , 分子量:174.19g/mol m= 0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g. DTT :配置体积:100ml ,浓度:0.2mol/L ,分子量:154.25g/mol m= 0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g. (2).再把 60%percoll CSK 缓冲液(60%percoll, 100 mol L KCl, 3mmol L MgCl2, 1 mmol L EGTA(pH8.0), 10 mmol LPIPES(pH6.8), 300mmol Lsucrose, 1.2mmol LPMSF, 20mmol LDTT)轻轻地平铺于它的上方, 名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实际g 母液体积 备注 percoll 60% 100ml 100ml 60% 60 100ml 2 KCl 100mol/L 10ml 10ml 100mol/L 74.6 10mL MgCl2 0.003mol/L 100ml 1ml 0.3mol/L 2.8563 100mL EGTA 0.001mol/L 100ml 1ml 0.1mol/L 3.8035 100mL Ph=8.0 PIPES 0.01mol/L 100ml 10ml 0.1mol/L 3.024 100mL Ph=6.8 sucrose 0.3mol 100ml 100ml 0.3mol/L 10.269 100mL PMSF苯甲基磺酰氟(剧毒) 0.0012mol L 100ml 1ml 0.12mol/L 2.0903 100mL DTT 0.02mol L 100ml 10ml 0.2mol/L 3.085 100mL 计算过程: KCl:配置体积:10ml , 浓度:100mol/L ,分子量:74.6g/mol m= 100mol/L*10mL*74.6g/mol=74.6g. MgCl2:配置体积:100ml ,浓度:0.3mol/L ,分子量:95.21g/mol m= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g. EGTA: 配置体积:100ml , 浓度:0.1mol/L ,分子量:380.35g/mol m=cv/M=0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g. PIPES:配置体积:100ml ,浓度:0.1mol/L 分子量:302.40g/mol m= 0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024 g. Sucrose:配置体积:100ml ,浓度:0.3mol/L ,分子量:342.3g/mol m= 0.3mol/L*100mL*342.3g/mol=10.269 g. PMSF:配置体积:100ml ,浓度:0.12mol/L ,分子量:174.19g/mol m= 0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g. DTT:配置体积:100ml,浓度:0.2mol/L 分子量:154.25g/mol m= 0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g. (3).用移液枪加时要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一溶液之上.这时应该能观察到溶液明显的分层现象, (4).然后把粗提细胞核与叶绿体的混合物用 CSK 缓冲液悬起并轻轻的平铺于上述两层的溶液顶部, (5).最终形成三层溶液各居其层, (6). 200 g 离心 32min.溶液梯度层重新分布, (7).叶绿体沉于离心管底部, (8).细胞核分布于 2.3mol/L 蔗糖的 CSK 缓冲液与 60%percoll CSK 缓冲液的交界处一薄层中, (9).用移液枪小心吸出这一薄层,再加入 2 倍体积的 CSK 缓冲液,12000g 离心5min,沉淀即为纯化的细胞核, (10).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核的纯化情况.并用 1/400 mm2 的血细胞计数板对从烟草悬浮细胞中提取的细胞核计数. 四、液泡的分离 1 原生质体分离步骤 同细胞核的分离 2.酶液配制 2 酶的种类及配比根据酶解材料选择. 应用的酶主要有果胶酶 Y-23(pectolyase Y-23)、 果胶酶 R-10(离析酶 macerozyme R-10)、 纤维素酶 RS(celllase "ONOZUKA") 、 纤维素酶 R-10(cellulase "ONOZUKA"R-10) 等. 3.取材 制备原生质体时要将冲洗过的组织,表面用70%的乙醇消毒 30 s.有的研究者认为,将消毒后的组织剥去表皮并切成0. 5~2mm 的小条块;对于难于剥去表皮的叶片,如禾本科的一些植物,可直接切成小条.适当的萎蔫有利于原生质体分离. 4.分离与纯化 1.将处理好的材料放入直径 6cm 的培养皿中. 2.每 2g 材料加入酶液 10mL,在 25~30℃酶解 6~12 h. 3.每隔 30m in 镜检一次,直到有一定数量的原生质体释放出来为止. 4.将酶解好的混合液通过尼龙网或金属网过滤,一般 40~100μm. 5.用含渗透剂浓度较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面,常用的渗透剂有(蔗糖、山梨醇或甘露醇). 6.将从叶片酶解得来的原生质体混合液在 500×g 离心 5m in,使原生质体与杂质一起沉淀. 7.去上清液后用 25%的蔗糖使之悬浮,在 1500×g 离心 5 m in,弃沉淀,将上清液用蒸馏水稀释 3 倍,再在 500×g 离心 5m in;沉淀即为纯化的原生质体. 5 液泡分离 5.1 渗透裂解法 (1).酶法制备原生质体,在制备好的 120mL 原生质体悬浮液中迅速(15s 内)加入等体积的介质溶液. (2). 介质溶液成分及浓度为: 3mmol/LMgCl2, 1mmol/L DDT(二硫基苏糖醇), pH 用 HCl 调节到 8. 名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取g 实 际g 母液体积 备注 MgCl2, 0.003mol/L 100ml 1ml 0.3 2.8563 100mL DDT (二硫基苏糖醇) 0.001mol/L 100ml 1ml 0.1 1.5425 100mL 计算过程: MgCl2:配置体积:100ml ,浓度:0.3mol/L ,分子量:95.21g/mol m= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g. DDT:配置体积:100ml ,浓度:0.1mol/L ,分子量:154.25g/mol m=cv/M=0.1mol/L*100mL*154.25g/mol=1.5425g. (3).缓慢摇动后得到一个均一的悬浮液.用一个多浆叶的搅拌器搅拌 2~4 m in,转速为每分钟 15 转. (4).去掉搅拌器将悬浮液通过 1mm 孔径的塑料板过滤,然后再通过 2 层玻璃棉. (5).得到的悬浮液在23×g 下离心 3m in 使一些杂质沉淀,将上部清液转移到另 2 一个 250mL 的离心管中,用一木条缓慢搅拌使其成为均一悬浮液;而残余的聚合团和碎片附着在木条上.去掉木条,在 100×g 下离团和碎片附着在木条上. (6).心悬浮液 3m in,去掉上清液得到的沉淀即为含大量色素的液泡;而不含色素的液泡需要在 1100×g 离心 3m in 才能获得. 。

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