Odyssey红外激光成像系统—蛋白研究的多功能平台课件.ppt

Odyssey红外激光成像系统 —蛋白研究的多功能平台Western Blot 常常见检测见检测方法方法n n化学化学化学化学显显显显色法色法色法色法: : 灵敏度低，无法定量灵敏度低，无法定量灵敏度低，无法定量灵敏度低，无法定量 n n放射自放射自放射自放射自显显显显影法：影法：影法：影法： 对对对对身体有害，操作复身体有害，操作复身体有害，操作复身体有害，操作复杂杂杂杂n n化学化学化学化学发发发发光法光法光法光法 : : 无法精确定量，操作复无法精确定量，操作复无法精确定量，操作复无法精确定量，操作复杂杂杂杂抗原抗原一抗结合一抗结合红外荧光标记的二抗红外荧光标记的二抗 Infrared dye (IRD800, Alexa680)ODYSSEY成像原理成像原理INFRAREDINFRAREDLASER LASER DIODEDIODEINFRARED INFRARED APD APD DETECTORDETECTORl准确定量准确定量Wide linear dynamic rangel操作简便操作简便,直接检测直接检测No film, darkroom, or messy substratesl灵敏度高灵敏度高Equal to or better than chemiluminescencel多色检测多色检测Normalization increases quantification accuracyOdyssey系系统统的特点的特点红外荧光红外荧光－准确定量－准确定量TIMETIMECHEMILUMINESCENCE• 动态信号－信号随时间变化• 信号不与目标蛋白浓度成比例关系ODYSSEY• 静态信号－信号不随时间变化• 信号和目标蛋白浓度成比例关系High concentration / signalMedium concentration / signalLow concentration / signalSaturationBackground0,00,0INTENSITY红外荧光定量红外荧光定量Western－－DEMO实验步骤Odyssey:膜+一抗孵育+荧光标记抗体孵育+Odyssey扫描成像ECL:膜+一抗孵育+酶联二抗孵育+底物显色+ UVP扫描成像实验目的 检测培养细胞转染外源基因的表达状况红外荧光定量红外荧光定量Western－－ DEMOMarker S1 S2 S3 S4Marker S1 S2 S3 S4Odyssey结果 ECL结果 信号强度 51 20 10 4信号强度 302 62 30 19（Odyssey软件分析结果） 结论ØOdyssey和ECL的相对灵敏度相差不大ØOdyssey红外激光成像系统具有更好的线性关系和更精确的定量结果 ØOdyssey扫描图能同时看到Marker 和目标蛋白，ECL看不到 Marker10:4:2:1 稀释 红外荧光优点红外荧光优点－直接检测，操作简便－直接检测，操作简便膜上抗原一抗结合红外标记的二抗 Odyssey直接扫描直接扫描Infrared dye (IRD800, Alexa680) ü不需要底物不需要底物ü不需要底片不需要底片/暗室暗室ü信号持久信号持久Odyssey VS ECL流程ECLOdyssey1跑胶跑胶2转膜转膜3封闭封闭4结合一抗、洗涤结合一抗、洗涤5结合酶标记二抗、洗涤结合红外染料标记二抗、洗涤，成像6发光试剂盒7暗房曝光成像红外荧光优点红外荧光优点－低背景－低背景NIR DyesBiomoleculesPorphyrinsVisible FluorophoresPAHs1000 nm800600400200All othersequencers400-650 nmLI-COR700 - 800 nm硝酸纤维, 聚偏氟乙稀（PVDF）,生物分子和尼龙等物质在可见荧光范围内有很高的自身荧光。

红外荧光红外荧光 vs 可见荧光可见荧光膜背景信号膜背景信号红外红外——背景低、背景低、SN更高更高红外荧光红外荧光 VS 化学发光化学发光定量线性范围定量线性范围Odyssey成像呈现一个很好的线性（定量准确）成像呈现一个很好的线性（定量准确）ECLODYSSEY红外荧光红外荧光 VS 化学发光化学发光线性宽的成像效果线性宽的成像效果　　Odyssey曝光３０秒曝光３０秒曝光１分钟曝光１分钟曝光５分钟曝光５分钟曝光１０分钟曝光１０分钟Odyssey—双色同时检测双色同时检测800 nm700 nmOverlay•两套独立激发检测系统•700通道：680nm激发 720nm检测•800通道：780nm激发 820nm检测应用一：双色－应用一：双色－定量定量western检测检测Target proteinAnti-rabbit 800 channelNormalizer targetAnti-mouse 700 channel* Two-color detection requires primary antibodies from different hosts应用二：双色－应用二：双色－ERK的磷酸化的磷酸化Anti-ERKAnti-phospho ERKResults OverlaidNon-StimulatedEGF-StimulatedNon-StimulatedEGF-StimulatedNon-StimulatedEGF-Stimulated700 nm channel800 nm channel700 and 800 nm观察EGF刺激后A431细胞中ERK1 and ERK2 (p44/42 MAP kinases)的磷酸化情况, 一抗分别是兔抗ERK抗体和小鼠抗磷酸化ERK抗体,二抗用 抗兔的IRDye800 标记的抗体 (green),和抗鼠的 Alexa680 标记的抗体 (red)ERK:胞外信号调节激酶 EGF:表皮生长因子EMSA的简介•EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是研究凝胶迁移实验是研究DNA与蛋白质或与蛋白质或RNA与蛋白与蛋白质相互作用的常用技术。

质相互作用的常用技术•该技术是基于该技术是基于DNA/蛋白质或蛋白质或RNA/蛋白质复合体蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率）中有不同迁移率的原理当蛋白质与一条人工合成的特异的的原理当蛋白质与一条人工合成的特异的DNA或或RNA结合后，其在结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结中的迁移率将小于未结合的合的DNA，从而检测到活化的与，从而检测到活化的与DNA或或RNA结合结合的蛋白，一般为转录或调控因子的蛋白，一般为转录或调控因子EMSA•起初是用32P同位素标记寡核苷酸探针,但是由于同位素的放射性很强,而且半衰期为14天,从定购同位素到标记，做完试验,必须14天完成,既不安全也不方便；•地高辛标记探针的非放射EMSA实验技术，其缺陷是标记的探针纯化后灵敏度弱；•红外荧光素技术的出现，可以解决EMSA实验中的探针示踪问题，还可以进行双色标记，检测竞争性结合应用三－应用三－双色双色EMSABinding of T7 RNAP to two DNA fragments containing the T7 promoter sequence, labeled with either IRDye 700 (red) or IRDye 800 (green).700 and 800 Overlay700 nm Channel800 nm ChannelDNA-Protein ComplexUnbound DNA IRDye 800Unbound DNA IRDye 700Odyssey双色检测的优越性双色检测的优越性Ø双色输出，两个目标蛋白或核酸同时检测，减少了工作量，而且杂交条件均等，便于两个数据的对比Ø杂交结果对比输出，结论更加直观，一目了然Ø可进行准确的量化分析In-Cell Western AssayThe Odyssey In-Cell Western (ICW) Assay is a high-throughput approach to simultaneously detect and quantify two separate proteins directly within cells.细胞培养 Culture cells to confluency in 96-well or 384-well plates处理细胞 Treat cells (inhibitor, stimulator, etc…)固定细胞 Fix cells (3.7%formaldehyde, methanol or Prefer)透化细胞 Permeabilize cells (0.1%Triton-X 100)Incubate with IRDye® secondary antibodies(e.g.: IRDye® 680 and IRDye® 800CW)Incubate with 2 primary antibodiesIncubate with 1 primary antibodyIncubate with IRDye® secondary antibody anda DNA stain (e.g.: To-Pro-3)Odyssey系统扫描 Scan plate directly and analyze on the LI-COR Infrared Imaging Systems.In-Cell Western 工作流程工作流程Membrane Westerns vs ICWEGF抑制剂对抑制剂对ERK磷酸化水平的影响磷酸化水平的影响随着药物浓度的增加，蛋白质的活性形式出现了变化。

这样的技术平台对于药物的筛选和高通量信号转导通路的分析也是最佳选择ERK:胞外信号调节激酶 EGF:表皮生长因子 µm nmInhibitor - - 3 1.5 750 375 180 90 45 22 11 5.5EGF - + + + + + + + + + + +700/800 nm 800 nm (Total ERK) 700 nm phosphorylated ERK Odyssey的的扩扩展展应应用用Ø活体荧光检测Ø 考马斯亮蓝凝胶分析Ø组织切片成像活体动物成像•随着医学及生物学研究的飞速发展，越来越多的科研人员希望将分子及细胞生物学技术从传统的体外研究延伸到活体动物体内，以直接监控活体生物体内的细胞活动和基因表达，有效地研究观测转基因动物生理过程，譬如活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发生发展过程等。

•活体动物光学成像技术作为新兴的成像技术以其操作简单、结果直观、灵敏度高、成本低等特点，成为活体动物成像的一种理想方法活体动物成像•活体动物体内光学成像分为生物发光和荧光两种技术•生物发光是利用荧光素酶基因标记目的核酸和细胞，在ATP和氧气存在时，通过荧光素酶催化注射进体内的底物荧光素，实现发光过程•荧光技术则是采用荧光素或荧光素基因标记多肽、抗体、小分子药物，在外界光源的激发下产生荧光•而传统荧光技术作为临床研究潜在的有力工具，自身的生物发光信号远弱于荧光信号，而且光在体内的传播会被散播和吸收，需要高灵敏度的检测仪器，成本非常昂贵同时，发光几乎都是酶-底物类型的反应，需要涉及不同种类转基因细胞株或转基因动物模型，复杂程度较高，所以和荧光技术相比，更容易受反应体系中的成分影响•不足在阻碍了在活体动物体内成像的应用 传统荧光技术的缺陷•1. 自发荧光干扰：在可见光激发光源下，活体小动物通常会产生较强的自发荧光，自发荧光主要是来源于皮毛(黑色素)和血液(血红蛋白)•2. 光的组织吸收：荧光成像时，光在动物组织内传播时会被折射和吸收，而且不同类型的细胞和组织对光子的吸收能力不同。

这就直接导致了特异荧光信号的衰减，无法捕获完整的体内真实信息•3. 灵敏度较低：由于活体动物产生的自发荧光会影响到检测灵敏度，特别是当发光细胞位于组织内部，则需要较高能量的激发光源，与此同时也就会产生较强的背景噪音，导致检测灵敏度下降 Licor 红外荧光技术的优点•* 极低的自发荧光干扰极低的自发荧光干扰•动物的自发荧光皮毛（黑色素）的发射光线波长峰值一般在500-520nm左右，血红蛋白的发射光线波长峰值一般在504-540nm左右，在大于600nm的近红外波段，活体内物质的自发荧光对于成像干扰小，背景噪音低，灵敏度高•* 良好的组织渗透性良好的组织渗透性•组织在可见光范围（350～600 nm，脂肪&血色素）及在红外线范围（>900nm,水）有较高的光吸收，而在近红外区域光吸收降到最低， 采用红外荧光检测系统，使得组织渗透性深度从几毫米上升到几厘米•* 无毒性和放射性，游离荧光染料清除快无毒性和放射性，游离荧光染料清除快•近红外荧光染料基团对活体无毒性，不具有放射性，而且游离的荧光基团可以在短时间内在动物体内淬灭清除，方便后续最优化检测可以真正无损伤地研究各项生理指标，数据结果真实可靠。

荧光活体成像的技术关键红外荧光：红外荧光：• •组织和细胞对近红外波长的光信号组织和细胞对近红外波长的光信号吸收最低吸收最低• •红外波段，光的散射更低红外波段，光的散射更低• •在近红外波长范围，自发荧光更低在近红外波长范围，自发荧光更低GFPRFPIRDye®低背景低背景低背景低背景高信噪比高信噪比高信噪比高信噪比活体成像关键：l 增加光信号的穿透性l 提高检测的灵敏度700-900 nm，,组织的光吸收系数最低，能穿透几厘米红外小动物活体成像 活体动物成像的福音•2009年5月8日，Science 发表钱永健教授文章：Mammalian Expression of Infrared Fluorescent Proteins Engineered from a Bacterial Phytochrome；•他们在Deinococcus radiodurans（耐辐射球菌）中发现一种可吸收红外线的蛋白质（光敏色素），研究人员对该基因进行改造，最终得出了一类红外线荧光蛋白质，但这些蛋白质仅能发出微弱的红外线因此研究人员又对经过改良的光敏色素基因进行了几轮的变异，进而选择出了发光能力最强的一种蛋白质。

•研究人员将这种新荧光蛋白质的基因插入了能够感染小鼠肝脏的一种腺病毒中将其和胆绿素(BV)一起注射入小鼠的尾部静脉血管，5天后，他们在啮齿动物的肝脏中发现了红外线荧光新红外蛋白质的结构，激发波长684nm,发射波长708nm，正是Odyssey 700nm通道，小图是活体小鼠发出的红外线mKate：588nm/635nm,IFP：684nm/708nmBV:胆绿素 Ad5：腺病毒载体红外小动物活体成像-附件Licor Pearl小动物成像系统--更为专业的选择软件功能•仪器软件–Administration–Diagnostics•应用软件–图象控制–背景扣除–条带发现和定位–定量–ICW % 结果计算(including normalization) –小动物活体分析试剂成本•红外二抗开放： LI-COR、Rockland、Invitrogen公司均可购买•红外二抗的成本： 与现有ECL二抗价格相当但是：但是：l红外二抗推荐1：15,000-20,000稀释使用，且可重复使用l无需发光底物l无需胶片注：ECL底物是Pierce公司（市场价），柯达胶片（市场价），国产显影液（未计成本）；ECL二抗为SantaCruz二抗（原价）；Odyssey二抗为Licor二抗（原价）；预染Marker为CST Marker（原价）。

用odyssey扫描，预染MARKER的用量为ECL的用量的1/5－1/10以上价格以2008年12月的各厂家的报价为准试剂试剂一张一张10x10cm western blot10x10cm western blot的费用的费用 Odyssey红外荧光化学发光1 color2 color1 colorStrip and Reprobe二抗二抗（Odyssey所用红外二抗推荐稀释浓度 Odyssey 1:15000；化学发光1:5000)48918化学发光底物试剂化学发光底物试剂(0.1ml/cm2) 004892X X光片及洗片试剂光片及洗片试剂(1 Films/blot) 002.44.8蛋白蛋白MarkersMarkers（推荐用量Odyssey 2uL;化学发光10uL）221010总计总计61069.4124.8Paper List•Reduced expression of inducible gelatinase B/matrix metalloproteinase-9 in monocytes from patients with myelodysplastic syndrome: correlation of inducible levels with the percentage of cytogenetically marked cells and with marrow cellularity Blood. 2007, 109(1): 85-92•Synaptic Protein Dynamics in Hibernation J. Neurosci. 2007, 27(1): 84-92•Surveillance mechanism linking Bub1 loss to the p53 pathway PNAS, May 2007; 104: 8334 - 8339.•Biomimetic amplification of nanoparticle homing to tumors PNAS, Jan 2007; 10.1073/pnas.0610298104.•Re-introduction of C/EBP in leukemic CD34+ stem/progenitor cells impairs self-renewal and partially restores myelopoiesis Blood, May 2007; 10.1182/blood-2006-10-052175.•A Nuclear Function of b-Arrestin1 in GPCR Signaling: Regulation of Histone Acetylation and Gene Transcription Cell 2005 123： 833–847•ATM Activation by DNA Double-Strand Breaks Through the Mre11-Rad50-Nbs1 Complex. Science 2005 308: 551-554Odyssey 系统概况系统概况•全球装机超过全球装机超过4,000 systems，国内，国内300套系统套系统•4,060 publications研究研究研究研究领领领领域域域域ü Signal Transduction Signal Transduction üü Apoptosis Apoptosis üü Protein Kinases Protein Kinasesüü Cell Biology Cell Biologyüü Microbiology Microbiologyüü Virology Virology 研究方法研究方法研究方法研究方法ü Quantitative WesternsQuantitative Westernsüü In-Cell Westerns In-Cell Westerns üü On-Cell Westerns On-Cell Westernsüü EMSA EMSA 总 结Ø准确定量准确定量—提供更完善的数据，提升文章档次提供更完善的数据，提升文章档次Ø成像效果好成像效果好—背景低，条带清晰，没有吹泡现象背景低，条带清晰，没有吹泡现象Ø双色检测双色检测—靶蛋白靶蛋白+总蛋白总蛋白+Maker 同时检测同时检测Ø成本低成本低—无需底物，无需胶片，无需暗室，二抗无需底物，无需胶片，无需暗室，二抗稀释倍数高稀释倍数高Ø扩展应用扩展应用—ICW，，EMSA,小动物活体成像等小动物活体成像等Thank you！。