紫外分光光度法测蛋白酶酶活.docx

1、原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并 使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定根据吸光度计 算其酶活力酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，lmin水解酪素 产生lug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示2、试剂和溶液 三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均 为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂2.1 三氯乙酸 c （CCL3 ・COOH） =0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000 mL02.2 氢氧化钠溶液 c （NaOH） =0.5mol/L按 GB601 配制02.3 盐酸溶液 c （HCL）=1 mol/L 及 0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL°0.1 mol/L HCL :取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL°2.4 缓冲溶液a、 磷酸缓冲液（pH=7.5 ）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（NaHPO ・12H O） 6.02g和磷酸二氢钠（NaH PO・12H O） 0.5g，加水溶解2 4 2 2 4 2并定容至 1000mL0b、 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液 称取乳酸（80%〜90%） 10.6g，加水溶解并定容至1000 mLo乙液称取乳酸钠（70%） 16g，加水溶解并定容至1000 mLo使用溶液取甲液8 mL,加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。

c、 硼酸缓冲溶液（pH=10.5 ）适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g,加水溶解并定容至1000 mLo乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mLo使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正2.5 10g/L 酪素溶液称取酪素l.OOOg,精确至O.OOlg,用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳 酸2〜3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅 拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天2.6 100ug/mL L—酪氨酸标准溶液a、 称取预先于105°C干燥至恒重的L —酪氨酸O.lOOOg，精确至0.0002g，用lmol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为lmg/mL酪氨酸标准溶液b、 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L —酪氨酸标准溶液此溶液在冰箱内贮存或立即使用。

3 仪器和设备3.1 恒温水浴 40±0.2C3.2 紫外分光光度计 应符合 GB 9721 的规定4 分析步骤4.1求K值按下表配制不同浓度的L —酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测 定其吸光度（A）,以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线 应通过零点），根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（|J g）,即 为吸光常数K值；（其K值应在（130〜135）范围内）管号酪氨酸标准溶液的浓 度（M g/mL）取100ug/mL酪氨酸 标准溶液的体积 mL取水的体积mL吸光值 Abs.0001011019220283303744046550554.2 测定吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00 mL,其它操作条件同福林 法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm 比色皿，测定其吸光度（A）a、先将酷素溶液放入40±0.2°C恒温水浴中，预热5min； b、按下列程序操作：试管A （空白）加酶液 2.00 mL40±0.2C， 2min试管B （酶试样，需作三个平行试样）加酶液 2.00 mL40±0.2C， 2min加酪素2.00mL （已预热）（摇匀）40±0.2C, lOmin （精确计时）加酪素2.00mL （已预热）（摇匀）40±0.2C, lOmin （精确计时）加三氯乙酸4.00mL （摇匀）继续加热lOmin,过滤或离心于 275nm 波长,测上清液吸光值继续加热lOmin,过滤或离心于 275nm 波长,测上清液吸光值加三氯乙酸4.00 mL （摇匀） c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30土0.2°C外，其它操作同4.2。

标准曲线 作同样处理5 计算在40C下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1 “g酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位X=AxKX8/2X1/10XnXE=2/5XAXKXnXE 式中：X——样品的酶活力，（u/mL）；A—试样溶液的平均吸光度；K——吸光常数；8——反应试剂的总体积, mL；2——吸取酶液 2.00mL；1/10 反应时间10min，以1min计；n 稀释倍数E——紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50 ；酸性蛋白酶系数 为0.77）所得结果表示至整数6 结果的允许差平行试验测定值之差不得超过3％。