产品内毒素检查.pdf

浙江 ** 药业股份有限公司SOP-QC-*** *** 内毒素标准操作规程1. 目的：建立样品中细菌内毒素检查方法标准操作规程，规范操作2. 适用范围：化验室3. 有关责任：化验室化验员对本规程的实施负责，化验室主任对本规程的有效执行承担监督检查责任4. 程序：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断样品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法内毒素的量用内毒素单位EU 表示4.1 试验材料及工具4.1.1分析天平4.1.2电热干燥箱（ 250℃）4.1.3恒温培养箱型号4.1.4旋涡混合器4.1.5微量移液器200～1000μ l 50～200μ l 4.1.6无热源吸头大号、小号、试管架、封口膜4.1.7鲎试剂（应具有国家主管部门的批准文号，我公司常用湛江安度斯）4.1.8细菌内毒素检查用水（ BET 水）4.1.9细菌内毒素工作标准品4.1.10无热源的小试管 10× 75mm 或无热源安瓿4.1.11无热源的小试管 15× 100mm 及无热源的药匙4.2 操作方法4.2.1实验准备将所有玻璃器皿及药匙用洗液（包括三效灭活剂）浸泡4小时以上，用清水及纯化水冲洗后，置250℃电热干燥箱中干热灭菌30 分钟以上。

试验过程中应防止微生物的污染4.2.2 供试品溶液制备精密称定样品 20mg 于无热源的 15× 100mm 小试管中，加混合液（ 280mg 96%乙醇溶液 +650mg 聚氧乙烯蓖麻油） 2ml，置自动旋涡混合器中30 秒使样品溶解后，再用 BET 水稀释成 1mg/ml 样品原液（ C） ，置自动旋涡混合器中混和30 秒浙江 ** 药业股份有限公司SOP-QC-*** 根据 L 值（限值），确定样品的最大有效稀释倍数（MVD ） ：MVD= c L / λ式中： L 为供试品的细菌内毒素限值；c 为供试品溶液浓度；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml). 例：L 值为 2EU/mg，鲎试剂的灵敏度λ 为 0.125EU/ml2EU/mg · C 2EU/mg×1mg/ml MVD= = = 16 倍λ 0.125EU/ml 吸取样品原液（浓度为1mg/ml）按如下表 1 稀释制得供试品溶液：表 1 L 值MVD 原液体积加 BET 水量（=总体积－吸原液体积）供试品溶液总体积2 EU/g 16 0.1 ml 1.5 ml 1.6 ml 4.2.2 内毒素工作标准溶液的制备根据鲎试剂灵敏度的标示值，取细菌内毒素工作标准品一支，加入1ml BET 水，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15 分钟，然后制成所需浓度的细菌内毒素标准溶液（ 2λ ）每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒。

例：细菌内毒素工作标准品为50EU/支，加 BET 水 1ml 即 50EU/ml，如鲎试剂灵敏度为 0.125λ ，那么细菌内毒素标准溶液应当为2× 0.125λ =0.25λ 即 0.25EU/ml应按以下方式进行稀释： 0.3ml 0.5ml 1ml 1ml 1ml 50EU/ml 5EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 2.7ml 2.0ml 1ml 1ml 1ml 4λ2λλ4.2.4 凝胶限度试验在制备内毒素工作标准溶液的同时，取鲎试剂8 支，按表 2 制备溶液 A、B、C、D编号内毒素浓度 /配制内毒素的溶液平行管数备注A 无/供试品溶液2 供试品溶液B 2λ /供试品溶液2 供试品溶液阳性对照C 2λ / BET 水2 阳性对照浙江 ** 药业股份有限公司SOP-QC-*** D 无/ BET 水2 阴性对照A: 鲎试剂加 0.1mlBET 水复溶，再加入 0.1ml 供试品溶液，为供试品管；B: 鲎试剂加入 0.1ml 供试品溶液复溶，再加2λ 内毒素标准溶液，为供试品阳性对照管，即（ PPC管） ；C: 鲎试剂加 0.1mlBET 水复溶，再加入 0.1ml 内毒素标准溶液，为阳性对照管；D: 鲎试剂加 0.1mlBET 水复溶，再加入 0.1ml BET 水，为阴性对照管。

加样结束后，封口，放入37± 1℃的恒温装置内保温60± 2 分钟后观察结果将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180° 时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（ +） ；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-） 结果判断：若阴性对照溶液 D 的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性，阳性对照溶液 C 的平行管均为阳性，试验有效若溶液 A 的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定（小于L 值） 若溶液 A 的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定若溶液A 的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试复试时溶液A 需做 4 支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定5. 鲎试剂灵敏度复核试验5.1 实验准备 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用纯化水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放入250℃电热干燥箱干热灭菌30分钟以上达到规定时间后，关断电源，待干燥箱温度自然降至室温在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干热灭菌30 分钟以上 除去可能存在的外源性内毒素。

5.2 鲎试剂灵敏度复核5.2.1 细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕， 75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内按照标准品说明书， 加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶浙江 ** 药业股份有限公司SOP-QC-*** 口封严，置旋涡混合器上混合15 分钟然后进行稀释，制备成4 个浓度的细菌内毒素标准溶液，即 2λ 、λ 、0.5λ 、0.25λ （λ 为所复核的鲎试剂的标示灵敏度） ，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒钟5.2.2.待复核鲎试剂的准备取规格为 0.1ml/ 支的鲎试剂 18 支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕， 75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡5.2.3.加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18 支（管）放在试管架上，排成5 列，其中 4 列4 支（管） ，1 列 2 支（管） 4 支（管） 4 列每列每支分别加入0.1ml 的 2λ 、λ 、0.5 λ、和 0.25λ 的内毒素标准溶液；另2 支（管）加入 0.1ml 检查用水。

5.2.4.反应：加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入 37℃± 1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60± 2 分钟5.2.5. 观察并记录结果：将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转 180° 观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+） ；未形成凝胶或形成凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）5.2.6 判断依据：如最大浓度 2λ, 4 管均为阳性，最低浓度 0.25λ, 4 管均为阴性， 阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc） λc = antilg ( ∑X/4)式中 X - 反应终点浓度的对数值（lg） 反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度当 λc 在 0.5λ ～2λ （包括 0.5λ 和 2λ ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以 λ（标示灵敏度） 为该批鲎试剂的灵敏度5.3. 再试验：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

5.4 注意事项：新购入鲎试剂， BET 水，细菌内毒素工作对照品都需做鲎试剂灵敏度复核试验浙江 ** 药业股份有限公司SOP-QC-*** 6. 干扰试验6.1 目的：通过比较鲎试剂在内毒素水溶液和内毒素供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对细菌内毒素检查有干扰6.2. 试验程序6.2.1. 内毒素限值 L 值例：内毒素的限值L 值为 2EU/g6.2.2. 选择：鲎试剂灵敏度λλ= 0. 125 EU/ml 6.2.3.确定供试品的最大有效稀释倍数λLMVDMVD=2/0.125=16 6.2.4.制备：6.2.4.1 鲎试剂标示灵敏度的对照系列：2λ 、λ 、0.5 λ、0.25 λ 内毒素水溶液 Es系列取 1 支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15 分钟，然后稀释制成4 个浓度的标准溶液即2λ 、λ 、0.5 λ、0.25 λ ，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30 秒6.2.4.2 干扰试验系列： 2λ 、λ 、0.5 λ、0.25 λ 内毒素供试品溶液Et系列（用供试品稀释液代替 BET 水对内毒素进行稀释）将供试品稀释初筛试验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液另取1 支细菌内毒素标准品稀释成4 个浓度即 2λ 、λ 、0.5λ 、0.25λ 的含内毒素的供试品溶液。

稀释方法同上6.2.5 操作取规格为 0.1ml/支的鲎试剂 30 支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡TAL+BET 水（NC） ，平行 2 管将准备好的鲎试剂取其中2 支（管）放在试管架上，排成1 列，1 列 2 支（管） ，每支分别加入 0.1ml 检查用水作为阴性对照；TAL+Es系列，平行 2 管将准备好的鲎试剂取其中8 支（管）放在试管架上，排成4 列，每列 2 支（管） ，每支分别加入 0.1ml 的 2λ 、λ 、0.5λ 、0.25λ 的内毒素标准溶液，作为鲎试剂标示灵敏浙江 ** 药业股份有限公司SOP-QC-*** 度的对照系列；TAL+供试品溶液（ NPC） ，平行 4 管将准备好的鲎试剂取4 支（管）鲎试剂放在试管架上，排成1 列 4 支（管） ，每支（管）分别加入0.1ml 供试品溶液作为供试品溶液；TAL+Et系列，平行 4 管将准备好的鲎试剂另取16 支（管）鲎试剂放在试管架上，排成4 列，每列 4 支（管） ，每支分别加入0.1ml 的含 2λ 、λ 、0.5λ 、0.25λ 的内毒素的供试品溶液，为干扰试验系列。

反应： 加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37± 1℃水浴或适宜恒温器中，保温60± 2 分钟后，观察并记录结果6.2.7.结果判断：试验有效：NC 管全部阴性（ - -） ，NPC 管全部阴性（ - - - -）TAL+Es系列： 2λ管全部阳性（ + + ） ，0.25λ 管全部阴性（ - -）TAL+Et系列： 2λ 管全部阳性（ + + + +） ，0.25λ 管全部阴性（ - - - -）6.2.8.数据处理：Es系列反应终点浓度几何平均值：ES=lg-1( ∑ XS/2) Et系列反应终点浓度几何平均值：）（4/lgt1 tXEEs和 Et分别在 2.0λ~0.5λ（0.5EU/ml~0.125EU/ml）范围内，供试品在该浓度下无干扰若供试品在该浓度下有干扰，选择灵敏度更高的鲎试剂6.3. 再试验：如鲎试剂和供试品在有以下改变，则须重新进行干扰试验：①鲎试剂来源的改变②鲎试剂的配方和生产工艺的改变③供试品来源的改变④供试品的配方和生产工艺的改变。