实验三细菌的分布与消毒灭菌.doc

实验三 细菌的分布与消毒灭菌【目的】①理解细菌广泛分布于自然界及正常人体，树立“有菌观念”，从而结识无菌操作对于微生物学及医学实践的重要性 　 　②理解正常人体中寄居着种类繁多的细菌，正常状况下不引起人类疾病,称为正常菌群　 ③熟悉外界因素对细菌的影响，学习常用的消毒灭菌措施④理解不同细菌对外界因素具有不同的抵御力一、细菌的分布检查（一)空气中的细菌检查【材料】一般琼脂平板培养基　 【措施】 ①取一般琼脂平板一只启动皿盖,培养基面向上放于实验桌上，暴露5~30ｍin后盖好 　②置３7℃培养1８～24小时后观测成果成果】(填表10-１）　平板培养基表面或多或少有菌落生长 　 （二）地面水中的细菌检查【材料】 地面水(河水、井水或池水)、高层琼脂培养基、1ｍl无菌吸管、灭菌培养皿　 【措施】 　①以无菌吸管吸取1mｌ地面水,加入灭菌平皿中 　 ②将已溶化且冷至45℃左右的高层琼脂倾注人上述平皿中,加盖后轻轻摇动，使水与琼脂充足混匀，静凝③37℃ 24小时后取出观测，计数菌落成果】（填表１０-1）(三)衣服、票证、头发、手指皮肤上的细菌检查【材料】一般琼脂平板培养基。

措施】取一般平板一种,用蜡笔在平板背面玻璃上划成四等分，并贴上标签(图1０-1）然后以无菌操作法，用衣袖角、票证、头发及手指或指甲内污物，在平板培养基表面相应部位轻轻涂抹，置37℃培养２4小时，观测并记录成果成果】填表培养基表面涂抹处有菌落生长 　　　 　　 衣服、票证、头发、手指皮肤上的细菌检查 　（四)正常人体咽喉部的细菌检查　 　 　 　 　　　　 【材料】 　　 　　　 　 　 　 　 血液琼脂平板培养基、灭菌棉拭、接种环、酒精灯 　【措施】 取灭菌棉拭一支,在被检查者咽喉部轻轻涂擦后,再涂于血液琼脂培养基—侧,然后改用灭菌接种环作分离划线接种盖上皿盖,37℃孵育２4小时（或者采用咳喋法)成果】(填表10-1)琼脂平板表面有菌落生长其中占优势的是一种细小菌落,其周边有草绿色的不完全溶血环此为咽喉部的正常菌群—甲型链球菌五)实验成果观测(填表）　　细菌分布的实验成果检查材料空气水衣角票证头发手指咽喉部细菌生长状况菌落个数实验体会　二、消毒灭菌实验 (一）煮沸与高压灭菌法【原理】　 高温对细菌有明显的致死作用,重要机制是凝固菌体蛋白质，也也许与细菌DＮA单螺旋断裂、细菌细胞膜功能受损及菌体内电解质浓缩有关。

湿热灭菌法所需温度比干热法为低，时间较短特别是高压蒸气灭菌,因增长压力而提高沸点,灭菌效果最佳有芽胞的细菌由于对热的抵御力比无芽胞细菌强,因此只有采用高压蒸气灭菌法才干将芽胞彻底杀灭材料】琼脂平板两块、肉汤管两支、大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌肉汤培养物措施】　①取琼脂平板两块,用记号笔分别在二平板底部玻面上，注明大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌,并分别将二块平板底玻璃面划分三等份,于每块平板的三等份上分别注明对照、加热１０0℃ 10ｍin及加热12１℃　20ｍｉn ②取肉汤管二支，分别注明加热１00℃ ｌ0miｎ及加热1２１℃ 20mｉn，用毛细吸管吸取大肠埃希菌肉汤培养物,于上述二支肉汤管中各加入菌液一滴混匀，再用接种环于二支肉汤管的任何一管中取一环菌液接种于大肠埃希菌平板的对照处，然后分别将肉汤管加热１00℃　ｌ0min及加热121℃ ２0min(高压蒸气15磅、２0min）,再各取一接种环分别接种于平板的相应部位枯草芽胞杆菌以同法实验③将二块琼脂平板接种物置37℃培养24小时，比较培养基上二种细菌的生长状况成果观测】(填表10－２)表10-2 煮沸和高压灭菌实验成果细菌名称1００℃ 1０分钟121℃ 2０分钟未加热(对照)枯草芽胞杆菌大肠埃希菌成果分析　　 　 　 　　 　　　 　 　　　　 　　(二）紫外线杀菌法【原理】波长26５～２66nm的紫外线因与ＤNA吸取光谱-致而有明显的杀菌作用。

其机制是使细菌ＤＮA相邻的胸腺嘧啶形成二聚体,从而破坏DＮA构型,干扰其正常复制，导致细菌死亡紫外线杀菌力虽强，但穿透力弱，故只能用于实验室、病房或手术室内空气及物体表面的消毒灭菌此外,杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛等有损伤作用,应注意防护材料】大肠埃希菌培养物、琼脂平板、接种环、酒精灯、紫外线灯措施】①以灭菌接种环挑取大肠埃希菌培养物,于琼脂平板上作来回密集划线接种②半启皿盖(将皿盖遮住涂面的1／2)，置于紫外线灯下lｍ以内接受照射3０分钟③盖上皿盖，于３7℃培养2４小时后观测成果 【成果观测】(填空） 　平板上用黑纸遮盖部分　 　　 菌生长，未遮盖部分 　 菌生长这阐明紫外线具有 　　 　　 　　 　 　 　 　 作用，但 　 　 　　 　 　 力弱三)化学消毒法1、皮肤消毒实验【原理】乙醇可使菌体蛋白脱水凝固或与菌体蛋白、酶蛋白等结合而使之变性失活70％~75 ％乙醇在１5~30秒即将细菌杀死但9５％的乙醇消毒效果反不如７0％~75%为好，因高浓度乙醇使菌体蛋白表面迅速凝固，影响乙醇继续进入菌体内发挥作用2．5％的碘酒可使菌体酶蛋白中的硫氢基（-ＳH)变化，使酶失去活性,导致机能障碍而死亡。

材料】一般琼脂平板一种、２.5%碘酒、75％乙醇措施】取一般琼脂平板一种,用蜡笔在平板背面玻璃上划成五等分,并贴上标签；两人用手在培养基上各涂一格,然后用２.5％碘酒、７５％乙醇消毒手指后再各涂另一格，留一格作对照,盖好平板，置37℃温箱中培养２4小时观测成果成果】（填表)　 　 　 　 　 皮肤消毒实验成果37℃ ２４h培养细菌生长状况成果解释消毒前手指皮肤消毒后手指皮肤对照（不接种)２、 化学消毒剂对细菌的影响【原理】有些化学药物浓度高时能杀灭病原微生物,称为化学消毒剂；浓度低时能克制细菌生长,称为防腐剂由于化学消毒剂对人体细胞往往具有毒性作用，故只能外用不同细菌对不同的化学消毒剂具有不同的敏感性材料】１%龙胆紫、2%碘酒、2％红汞、1:100０新洁尔灭、无菌滤纸片、葡萄球菌培养液、大肠埃希菌培养液、琼脂平板、无齿小镊子措施】取琼脂平板两块，分别在其底部注明葡萄球菌及大肠埃希菌同步将每块平皿底部玻璃面划分４等分,并分别标明龙胆紫、碘酒、红汞、新洁尔灭操作措施与药敏实验相似)三、抗生素的抗菌实验(药敏实验,纸片法)【原理】抗生素重要是指某些微生物（大多数为放线菌和真菌、很少数为细菌)在生长繁殖过程中产生的一种合成代谢产物。

此种有机化合物具有抗生物作用，能克制或杀灭某些生物细胞,重要是某些微生物和肿瘤细胞一种抗生素只对一定种类的生物细胞具有选择性拮抗作用，这种作用范畴称为抗菌谱抗生素的抗菌实验(药敏实验)是指在体外测定药物克制或杀死细菌能力的实验材料】①金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、琼脂平板培养基②抗生素纸片（青、链、氯、庆大霉素、磺胺等）、尖头镊子、酒精灯、接种环措施】①取琼脂平板培养基二块,于其底部玻璃上用标签纸注明本人所接种的菌株名称（或将平板底部以蜡笔划为六等分，分别在接近边沿处注明青、链、氯、庆大等字样)②以灭菌接种环挑取菌液，在培养基表面作密集划线接种③将镊子火焰灭菌,待冷后再取各药物纸片，分别牢贴于种有细菌的平板培养基表面相应位置，每次贴片后镊子均应经火焰烧灼灭菌每张纸片间距不少于24ｍm，纸片中心距平皿边沿不少于15mm,并分别作好标记　 在直径90mm的平板上均匀摆放药敏纸片的样板④3７℃孵育18～24h后,分别测量各纸片抑菌环直径(涉及纸片在内)（mｍ)，抑菌环的边沿以肉眼见不到细菌明显生长为限鉴定其敏感度成果观测记录】填表药物敏感实验成果判断参照原则:抗菌药物抑 菌　圈 直 径(mｍ)耐药中度敏感敏感青霉素链霉素其他抗生素<1０＜１０＜1010～１210～1410~15≥13≥１5≥１6敏感:表达常规剂量的药物在体内所达到的浓度能克制或杀灭待测菌;中度敏感:指提高测定药物的剂量或在该药物浓集部位,细菌生长可被克制；耐药:表达常规剂量的药物在体内所达到的浓度不能克制或杀灭待测菌。

　 药物敏感实验(纸片扩散法)成果抗生素大肠埃希菌金黄色葡萄球菌抑菌圈直径（cｍ）敏感度抑菌圈直径(cm)敏感度青霉素红霉素庆大霉素先锋霉素氯霉素四、口腔内微生物检查（口腔专业) 【措施】①滴一滴墨汁于干净玻片的一端； 　 ②用牙签取齿间牙垢少量在墨汁中涂匀;③用玻片推成推片，干燥后油镜观测、绘图 　 【成果】（绘图) 　　　 　　 　 　　 口腔内微生物可见黑色背景中有着色发亮的细菌、螺旋体等微生物五、常用消毒灭菌器及无菌室简介(一)高压蒸气灭菌器【构造】高压蒸气灭菌器是双层的金属圆筒，盖旁附有螺旋,借以紧闭盖门，使蒸气不外溢因而当蒸气压力升高时，其温度亦相应地增高,高压蒸气灭菌器上装有排气门、安全活塞,以调节器内压力尚有温度表和压力表,以显示内部的温度和压力两者的关系见表１０－5器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌物品用法】加适量水于器内,放入欲灭菌物品，将盖关上,转紧螺旋使之密闭灭菌器底部用电炉加热,同步打开排气门,使器内冷气完全排出，否则压力表上所示压力并非所有为蒸气压力，再维持该压力2０分钟后,停止加压蒸气压力与温度的关系千帕斯卡　 　公斤/平方厘米 　 　 　 磅/平方吋 　　　 　 温度(kPa) 　 　(kg/cm２) 　　 (lb/ｉn.２） 　 　 (℃）34.4７　 　　０.３５　　 　 5 　　　　 　108．85５.２0　 　　 0.６0 　 　　　　8 　　　 　　　11３.0６８.94　 ０．7０ 　0　 　 1０　 　 115.610３.５0　　0０0 1.05 　 　　　　　0 15 　 　　　1２１.3137.80　 000　1.5０ 　 　 　0 ２０ 　 　　 1２6.２【注意事项】1．必须待压力逐渐自行下降至零时，才可开盖取物。

切不可忽然打开排气门,放气减压，以免瓶内液体冲出外溢2.用于耐高温和耐湿物品的灭菌,如一般培养基、手术器械、手术衣及敷料等二）干热灭菌器(干烤箱)【构造】箱壁为双层,两层间衬以石棉板隔热，底部装有电热线圈，箱壁有温度调节器。