小发夹RNA介导的基因沉默及其应用.doc

1小发夹 RNA 介导的基因沉默及其应用【关键词】 RNA 干扰；shRNA；基因功能分析；基因治疗发夹结构的 RNA（hairpin RNA）是 RNA 二级结构中最简单的它是由一条 RNA单链自身折叠，形成双链的茎，再加上一条单链的环构成，因此，发夹结构 RNA又称为茎环结构 RNA，在整个生物界中普遍存在最近，一类特殊的发夹RNA小发夹 RNA 显示参与了转录后基因表达的调控，这些 shRNA 在基因稳定沉默中起重要的作用shRNA 介导的 RNA 干扰技术已经成为研究哺乳动物细胞体内外基因功能强有力的工具1 siRNA、stRNA、miRNA 与 RNAiRNA 干扰（RNA interference，RNAi）是指正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，小干扰 RNA (small interference RNA, siRNA)是 RNAi 过程中重要的中间分子，是一类长约 21～23 个核苷酸(nt)的特殊双链 RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子，与所作用的靶 mRNA 序列具有同源性，RNAi 主要是通过dsRNA 被核酸酶切割成 siRNA， 再由 siRNA 介导识别并靶向切割同源性靶mRNA 分子而实现。

最近，虫和蠕虫中发现了 lin4 和 let7 RNA，这两种 RNA 均来自于 72nt具有发夹结构的前体 RNA，经加工形成 22nt 的 RNAlin4 和 let7 基因与发育的时序性有关，一旦突变，会引起异时序性的发育缺陷因其与发育的时序有关，所以称它们为 stRNAs(small temporal RNAs) ［1］同时在不同的生物体中，也已发现 90 多种发夹结构 RNA，可产生 21～23nt RNA，但它们不象 lin4 和 let7 一样时序性表达，因此将它们统称为 miRNAs(microRNAs) ［2］2stRNA、miRNA、siRNA 及 RNAi 有何关系呢？研究发现，Dicer 酶将 siRNA 和stRNA 联系起来，Dicer 酶可催化长 dsRNA 分解成 siRNA，同时还能将稳定发夹结构的前体 RNA 分解成 21～23nt 的 stRNA当用 siRNA 将 Hela 细胞中的 Dicer消除时，会发生 72nt 未加工的 let7 前体 RNA 的积累同样，在蠕虫中去除Dicer 酶，会引起发育的异时性，也会发生未加工的 let7 和 lin4 前体 RNA 的积累［1］。

eIF2C/Argonaute 家族是 RNAi 和 stRNA 的又一联系者当蠕虫eIF2C/Argonaute 家族中特异蛋白缺陷时，其发育呈异时性表型，同时未加工的lin4 和 let7 前体 RNA 积累［3］在植物体中，miRNA 的作用机制与 siRNA 介导的 mRNA 降解相似用免疫沉淀法发现两种与 SMN 复合体（survival of motor neurons complex）密切相关的蛋白 GEMIN3 和 GEMIN4miRNA 和 GEMIN3/4 复合体包含了与 Argonaute 同源的 eIF2C 和 Dicer 酶［4］因此，这一研究进一步揭示了内源性发夹 miRNA 与 RNAi 的关系2 shRNA 介导的 RNAi长发夹结构的 RNA(500～1000nt)分析基因功能的技术在低等生物中已大获成功在哺乳动物中，这种技术已在小鼠的胚胎干细胞中取得进展然而，在不同的哺乳动物体细胞中，试图用如此长的发夹结构 RNA 以介导持续的基因沉默，目前尚未成功可能是因为长发夹结构 RNA 活化了干扰素（IFN）相关途径，对基因表达缺乏特异性为避免 IFN 反应，人们正在试图用短的 dsRNA 结构来沉默靶基因。

研究发现，小于 30 个 nt 的 dsRNA 能特异性抑制基因表达，而不会造成非特异性作用在哺乳动物细胞中，shRNA 可以长期甚至稳定的发挥 RNAi 的作用，而不引起非特异性反应因此如何得到 shRNA 是维持长期 RNAi 作用的关键已有研究3者发展了基于 DNA 载体在体内表达 shRNA 的技术采用事先在体外构建能够表达 shRNA 的载体，再转移到细胞内转录 shRNA 的策略在所构建的 siRNA 表达载体中，由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成，是因为 RNA 聚合酶Ⅲ一方面在体内有较高的转录效率，另一方面有明确的起始和终止序列当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3’端形成1～4 个 U，这样就限制了 RNA 的大小，不会引起干扰素的非特异作用已有研究者应用聚合酶Ⅲ启动子鼠 U6、人 U6、H1RNA 及 ValtRNA 启动子成功构建了siRNA 表达载体［5～8］为找到决定发夹结构最佳效率的因素，有研究者观察了不同长度的茎和环构建的 shRNA 对 RNAi 效果的影响结果发现，shRNA 茎在 18～29 个核苷酸长度时，其 RNAi 的效果相当，无明显差异，但当超过 29 个核苷酸时，可能引起非特异性反应，而无 RNAi 作用［9］。

而 Paddison 等［10］却认为，长一点的 dsRNA（达到29nt）比短的 dsRNA 更富有沉默活性Sui 等［11］认为在 shRNA 茎结构中不论是5' 茎链，还是 3' 茎链，只要有一条茎序列和靶 mRNA 完全互补，就可以发挥RNAi 作用Yu 等［9］认为在 shRNA 环结构中从 3～9 个核苷酸长度都可以导致成功的靶基因沉默，当环结构更长时，可能导致 RNAi 作用失效而Brummelkamp［5］设计针对同一基因的三种 shRNA，分别由 5、7、9 个核苷酸组成的环，比较它们的 RNAi 效果却发现，有 9 个核苷酸环的 shRNA 沉默作用和siRNA 的作用相当，有 7 个核苷酸环的 shRNA 沉默作用较 9 个的要差些，而有 5个核苷酸环的 shRNA 几乎无沉默作用另有研究者认为，shRNA 介导的 RNAi 作用主要取决于靶序列，不同的基因之间以及同一个基因的不同靶序列之间，它们的基因沉默效果存在着很大的差异，这可能与靶 mRNA 的量、结构、转化效率以4及细胞类型等多种因素有关［12］到目前为止，决定发夹结构最佳效率的因素仍不清楚3 shRNA 介导的 RNAi 技术的应用3.1 基因功能的研究由于 RNAi 可以高效、高特异性地沉默特定基因，容易产生功能丧失或降低突变，因此它可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。

已有研究表明 RNAi 能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段或不同器官中有选择地进行，产生类似基因敲除的效应而与 siRNA 介导的 RNAi 作用相比，shRNA 介导的 RNAi 作用能更长期甚至稳定的抑制目的基因的表达，更适合于对目的基因功能进行长期研究3.2 疾病的治疗RNAi 可直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的在抗肿瘤治疗中，RNAi 可用于抑制癌基因的表达；也可用于抑制基因扩增或抑制融合基因表达；还可用于抑制其他肿瘤发生发展相关基因（如血管内皮生长因子VEGF、多药耐药基因 MDR 等）的表达已有很多学者利用 shRNA 介导的 RNAi作用，获得了长期甚至稳定抑制目的基因的作用，作用时间明显长于 siRNA 介导的 RNAi 作用时间，一般至少超过一周，有些甚至可以维持数月［1315］在治疗病毒性疾病的研究中，通过设计针对病毒基因组 RNA 的 shRNA 或针对宿主细胞病毒受体的 shRNA 来抗病毒，目前针对乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、HIV1、SARS 等均取得了令人欣喜的体外病毒抑制作用，shRNA 已显示出了长期的抑制效果。

Moore 等［16］利用腺相关病毒为载体在体外发现转5染针对 HBV 的 shRNA 后一周，HBV 能被抑制 90%，抑制作用在 5 个月后仍能检测到Wilson 等［17］用 siRNA 表达载体方法也可以使 HCV 病毒被抑制超过 3 周还可利用 RNAi 确定新的疾病相关基因，尤其是建立高通量的 RNAi 功能分析方法可以为下一步的药物筛选提供更多的可能靶蛋白；并可以利用 RNAi 来确认许多疾病的发生发展机制，为其治疗提供依据3.3 体内实验研究在哺乳动物中最好研究稳定 RNAi 作用的方法就是产生转基因动物传统的基因敲除技术需要大量的时间和精力的投入，这就限制了它用于大规模的基因功能研究由于 shRNAs 易于产生功能缺失的显性突变体，使得我们的基因功能研究变得相对容易最初的成功研究是在生殖细胞，接着 shRNA 介导的 RNAi 已成功用于转基因动物的大规模基因功能研究，最近的一项研究更充分显示了 RNAi 体内试验的灵活性，通过 3 种不同 shRNA 不同程度的降调造血干细胞中 p53 的水平，再将转染后的造血干细胞转入易患淋巴瘤的转基因小鼠体内，结果产生了由不同的 p53 水平所决定的不同表型，从良性的淋巴组织增生到恶性的淋巴瘤［18］。

这充分说明通过 shRNA 的不同程度的基因沉默可以产生不同的表型，这为我们进行体内基因功能的研究提供了有力的工具 3.4 转运方式的改进然而不管是体外合成 siRNA，还是基于载体的 siRNA 表达系统，由于缺少高效低毒的转运载体，其作用在很大程度上受到转染效率的限制事实上只有某些细胞系才可被有效转染，而对于原代细胞来说，几乎是不可能的病毒载体仍然是目前常用的在细胞与整体水平进行基因转移的有效工具逆转录病毒载体(retroviral 6vector)和腺相关病毒载体(Adenoassociated virus vector)能够在哺乳动物细胞系和原代细胞进行稳定有效的基因转移慢病毒载体(lentiviral vector)有更广的宿主范围，它能够产生表达 shRNA 的高滴度慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA用慢病毒载体构建的 siRNA 表达载体能在体外高效稳定地抑制 HIV1 基因的表达在单轮感染系统，shRNA 引起的抗病毒效应可持续 35 天，在多轮感染系统，shRNA 引起的抗病毒效应也至少可持续 7 天［19］慢病毒作为 shRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。

4 总结shRNA 介导的 RNAi 技术为基因功能及基因治疗研究提供了一种新的可供选择的方法，特别是在病毒感染性疾病的长期治疗研究中用病毒载体作为转运载体，为 RNAi 技术的更广泛运用提供了保障基因组高通量序列分析的自动化，shRNA 介导的 RNAi 技术也提供了一种相对便宜的自动分析基因缺失表型的方法，特别是在微阵列基础上的表型筛选研究中我们相信，随着研究的进展，shRNA 介导的 RNAi 技术必将为人类疾病的治疗作出重大贡献参考文献】［1］ Knight SW，Bass BL. A role for the Rnase III enzyme DCR1 in RNA interference and germ line development in C. elegans ［J］. Science， 2001， 293(5538): 22692271.［2］ Brennecke J, Hipfner DR, Stark A, et al. Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the p。